| 研究課題/領域番号 |
18K14472
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
宮田 佑吾 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 契約研究員 (70623453)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 乾燥耐性 |
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| 研究実績の概要 |
エネルギーフリー長期安定保存技術の開発に向けて、ネムリユスリカの乾燥耐性能は長らく注目を浴びてきた。しかしながら、その乾燥耐性メカニズムをゲノムワイドに探索する実験系が構築されていなかった。そこで申請者は、乾燥耐性能を持つ唯一の動物細胞株であるPv11細胞におけるゲノムワイドスクリーニング系の構築を試みた。
ゲノムワイドスクリーニングを実践するにあたり、必要な要素の一つにgRNA発現ライブラリーがある。このライブラリーベクターを作成するには、複雑度合いを維持した特別な増幅方法、「半個体培養」が必要になる。そこで実際に培養条件の検討を行なった。その結果、培養液の濃度や大腸菌量、培養時間、培養温度など、培養条件を最適化する事で、半個体培養の実験系構築に成功した。
次に、上記のgRNA発現ユニットをノックインするゲノム領域の検討を行なった。本課題におけるゲノムワイドスクリーニングでは、CRISPR/Cas9システムを用いて、gRNA発現ユニットをゲノム上に挿入する事が必須になる。しかし現在までに、Pv11細胞において、乾燥耐性能に影響を与えず、かつ発現ユニットを挿入できる領域が同定されていない。そこで、当該領域を同定するための検討を行なった。その結果、一つの領域においては、全く乾燥耐性能に影響を与えなかった。また、他にも複数領域を候補領域として同定した。
さらに、CRISPR/Cas9システムを用いた実験系の構築の過程で、乾燥耐性に寄与するシグナル経路も同定できた。
以上より、ゲノムワイドスクリーニングの基盤を構築しつつ、乾燥耐性メカニズムの解明も同時に進める事ができている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ネムリユスリカ細胞において、CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集技術の取得を予定通り終えた。さらに、gRNA発現ライブラリーベクターの構築に関しても目処が立った。また、概ね予定通り研究が進んでいる。Pv11細胞における、乾燥耐性能に影響を与えず、かつ発現ユニットを挿入できる領域の同定にも成功した。これらのことから、おおむね予定通り研究が進んでいる。
さらに、CRISPR/Cas9システムの構築の過程で、乾燥耐性能に寄与するシグナル経路を見出した。したがって、当初の予想を超えた成果が期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
哺乳類細胞で行われているゲノムワイドスクリーニングの手法に従って研究を進めていく。まず、gRNA発現ベクターライブラリを半個体培養法によって作成する。それを含む発現ユニットを、乾燥耐性能に影響を与えないゲノム領域に挿入する。挿入された細胞群を選抜し、乾燥―再水和実験を施すことで、乾燥耐性に必須の遺伝子を同定する。
また、乾燥耐性に寄与するシグナル経路から、乾燥耐性に必須の遺伝子を同定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
消耗品が当初計画より安価に購入できたため、次年度使用額が生じた。次年度において、より大規模に実験を行うことを予定している。
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