| 研究課題/領域番号 |
18K14481
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
中尾 遼平 神戸大学, 人間発達環境学研究科, 学術研究員 (10814618)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | メダカ / 環境DNA / 国内外来種 / 保全 |
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| 研究実績の概要 |
近年、メダカ種群では人工改良品種の「ヒメダカ」の放流による遺伝的撹乱が生じており、遺伝的多様性の均質化や喪失が各地で危惧されている。ヒメダカによる遺伝的撹乱の有無は外見上判別できないことから、従来、DNAマーカーを用いた遺伝解析手法が用いられてきた。しかし、従来法は体組織をサンプルとして用いることから侵襲的であり、外来遺伝子の頻度増減など長期的な現象を追っていくうえでの大きな制約となる。またメダカは絶滅危惧種であることから、個体および集団の存続に負の影響をあたえる調査は可能な限り控える必要がある。そこで本研究では、環境DNA手法を用いたメダカ種群における外来遺伝子の検出手法の確率を目的とした。環境DNA手法は、水などの環境サンプル中に含まれる生物由来のDNAを検出する手法である。本手法は、環境サンプルの採取だけでよいことから非破壊的および非侵襲的であり、近年生物のモニタリング手法として注目されている。本研究では、2018年度に、(1) 環境DNA手法による検出系の開発と(2) 1年目の採水調査を行った。(1) の検出系開発では、環境DNA用のプライマーおよびリアルタイムPCR用のプローブ開発を行った。検出系を用いてのPCR増幅は良好であり、野生メダカとヒメダカの両方で目的のPCR産物を得ることができた。しかし、プローブ設計においてヒメダカ側のみ若干の非特異的増幅がみられたことから、設計を変更する必要があると考えられた。(2) では、計画にそって2018年4月から2019年3月に毎月1回の定期採水調査を行い、計240サンプルを得た。検出系の改善後、これらのサンプルを順次解析にかけていく予定である。また、一部計画の変更は行うが、今年度も継続してサンプリングを行っていく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2018年度では、(1)メダカとヒメダカを検出するための環境DNAマーカーの開発、(2)東京都と奈良県における1年目の環境水サンプルの収集を行った。(1)では、従来法で使用されている核DNAマーカー（bマーカー）をもとに環境DNA用の検出系を作成し、組織DNAサンプルおよび飼育水サンプルでの検証を行った。検出系では、組織サンプルと水槽サンプルともに良好な増幅産物が得られた。このプライマーと増幅産物をもとに開発したプローブを用いてリアルタイムPCRを行ったところ、野生メダカの検出において良好な特異性が確認できた。ヒメダカの検出では、ヒメダカの検出が良好である一方で、野生メダカのDNAでも検出が確認されており、検出系の見直しと改善が必要となった。これは、ヒメダカ用の種特異検出に開発したプローブが野生メダカのDNAに結合したためであると考えられることから、ヒメダカのプライマーまたはプローブの設計部位を変更する必要があると考えられる。これに対する改善策として、ヒメダカの変異をより顕著に捉えることのできるプローブもしくはプライマーを再度開発する予定である。
(2)において、目標であった東京都多摩川水系の支流8地点および奈良県大和川水系12地点における毎月の採水調査により、計240の水サンプルを得た。これらのサンプルは、DNAマーカーの改良が終わり次第、リアルタイムPCRによる解析にかけていく。また、東京都の調査地では河川の改修工事がはじまったこと、湧水由来の河川であるため冬季に渇水にあるエリアがみられたことから、継続的な調査を行うことが困難となった。そのため、2019年度の定期採水調査では、東京都の調査地点数および調査時期に変更を加える必要があると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後本研究を遂行していくにあたり、種特異検出系の確立は必須である。野生メダカの検出系ではヒメダカの非特異的な検出を防止できていることから、ヒメダカ側の検出系の改善を行っていく必要がある。これについて、今年度は2種類の対策を試みる予定である。1つ目として、ヒメダカ用の新規プライマーセットの開発である。現在開発している検出系は、野生メダカとヒメダカに共通のプライマーを設計し、2種類のプローブを使い分けることで、メダカかヒメダカかの判別を行っている。ここから、メダカ用とヒメダカ用にそれぞれ個別のプライマーセットを開発することで、PCRの段階での検出の特異性を検討することとする。2つ目の対策として、リアルタイムPCR用のプローブの新規開発である。プローブの開発では、設計位置をヒメダカの変異部分に当てることで、野生メダカにプローブが結合しない地点を選定した。2019年度は、その部位をさらに精査することでより特異性の高い部位を選定し、改善を試みる予定である。検出系の確立後、2018年度のサンプルから順次リアルタイムPCRによる解析を行っていく。
2019年度の定期採水調査では、2018年度と同様に奈良県の採水調査を継続していく。東京都の河川については、河川改修工事の開始や冬季の渇水から、毎月の採水および2018年度と同様の調査を行うことができないと予想される。そのため、2019年度は新たに調査計画を変更し、4季節レベルでの採水調査に変更する予定である。調査地点の変更は現在のところ予定していないが、サンプリングが困難な場合は地点の上下流側への変更を考慮している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
昨年度の研究では、検出系開発においてプライマー設計の見直しおよび設計の再開があったことから、環境サンプルのDNA抽出およびリアルタイムPCRによる環境サンプルの分析が進行しなかったことが、次年度使用額の生じたもっとも大きな要因と考えられる。
今年度は、プライマーの再設計および完成を目指すとともに、昨年度および今年度のサンプルの解析を実施していく予定である。昨年度生じた次年度使用額を、環境サンプルの分析費用とすることを計画している。
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