研究課題
Mouse artificial chromosome (MAC)ベクターという人工染色体ベクターをGS細胞に導入し、Transchromosomic (Tc)マウスの作成に成功した。人工染色体は通常の遺伝子導入方法と異なり、①ホストゲノムへの挿入、②遺伝子発現のより忠実な再現などの点で優れている。人工染色体によりKit遺伝子の発現を再現できれば精子形成のみをレスキューしホストのゲノムには傷を付けずに遺伝子治療を行うことが可能である。その点、従来の手法ではゲノムDNAに変異が入るという問題があるために将来的にヒトの治療で用いることが出来ない。そこで、本研究では人工染色体による遺伝子操作技術を用いたWマウスの遺伝子治療実験を行うこととした。①WマウスからのGS細胞の樹立：新生児(5-10日齢)Wマウスの精巣から定法に従いGS細胞を樹立するこに成功した。②Kit遺伝子を持つBACの改変：Kit遺伝子を含むBACクローン（理研BRCより入手）にBAC recombineering用loxP-3’HPRT挿入ベクターを加えてエレクトロポレーションを行い、これによりBACにloxPサイトを導入した。③CHO細胞におけるCre-loxP組み替え：②で準備した環状ベクター及びCre発現ベクターをMACが保持されたCHO細胞に導入した。目的の遺伝子配列がCHO細胞のMACに導入できたかどうかを確認するため、MAC特異的プローブと目的遺伝子特異的プローブを用いたFISH解析により、目的遺伝子が内在CHO細胞内在の染色体に挿入されずMACに組み込まれか及び、MACが内在CHO細胞の染色体に転座していないかなどを確認し、MMCTに用いるためのクローンを選別し、染色体導入が可能なクローンを得ることに成功した。このクローンを共同研究者に送付し、retro-MMCT方の準備まで行うことが出来た。
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すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件)
Life Science Alliance
巻: 2 ページ: 2
10.26508/lsa.201900374
Scientific reports
巻: 9 ページ: 3445
10.1038/s41598-019-38910-2
Biology of Reproduction
巻: 100 ページ: 523-534
10.1093/biolre/ioy192
