| 研究課題/領域番号 |
18K14650
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
清水 隆之 東京大学, 大学院総合文化研究科, 助教 (90817214)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | シグナル制御 / システイン修飾 / 硫化水素 / パースルフィド |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、申請者が光合成細菌から新規に同定した活性イオウ分子種（Reactive sulfur species; RSS）応答性転写因子SqrRのRSS応答機構および本細菌のRSS代謝系の解析を通じ、RSSシグナル伝達の分子機構を理解することを目指している。
本研究は、これまでに申請者が明らかにしたSqrRのRSS応答機構を踏まえて、1）細胞内のSqrRに対するRSSによる安定な修飾の種類の解明、および、2）SqrRの修飾に関わるRSSの代謝経路の決定を行うことで、RSSによるシグナル伝達の分子機構の詳細解明を試みている。SqrRはRSSによって2つの保存されたシステイン残基の間で分子内テトラスルフィド結合が形成され、標的遺伝子のオペレーター領域へのDNA結合親和性が低下することがわかっている。この修飾について、細胞内のメジャーなRSSであるグルタチオンパースルフィド（GSSH）とシステインパースルフィド（CysSSH）に着目して、in vitroおよびin vivoでの解析を行ったところ、CysSSHによって安定的な修飾を受けることが示唆された。また、SqrRの修飾に関わるRSS代謝系に関して、メジャーな硫化水素酸化酵素であるSQRに着目して解析を行った。sqr遺伝子の欠損がSqrRによる遺伝子制御をおよぼすことがわかり、SQRによって産生されたRSSによってSqrRの活性が制御されている可能性が示唆された。さらに、sqr遺伝子欠損の影響はCysSSHの添加によって改善されることがわかった。以上より、現段階では、SqrRに対する主要な制御系は、SQRによって産生されるCysSSHによるパースルフィド化であることが考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は、これまでに申請者が明らかにしたSqrRのRSS応答機構を踏まえて、1）細胞内のSqrRに対するRSSによる安定な修飾の種類の解明、2）SqrRの修飾に関わるRSSの代謝経路の決定の2つのアプローチによって進め、それらの成果を有機的に結びつけることで、RSSによるシグナル伝達の分子機構の詳細解明を試みている。今年度の各研究の研究状況を以下に記す。
1）細胞内のSqrRに対するRSSによる安定な修飾の種類の解明：細胞内のメジャーなRSSであるGSSHとCysSSHに対するSqrRの感受性について調べるため、大腸菌から精製したリコンビナントSqrRタンパク質に対するGSSHおよびCysSSHのKd値を求めた。CysSSHのKd値の方が低く、SqrRはCysSSHとの反応性が高いことがわかった。また、SqrRによって制御を受ける遺伝子のプロモーター活性を指標に、in vivoでの各RSSの影響を観察したところ、細胞を硫化水素だけで処理、あるいはCysSSHで処理したときに比べ、GSSHで同時処理したときの方が、SqrRの活性が抑制されなかった。この結果は、in vivoでもCysSSHによる修飾がメジャーであることを示唆する。
2）SqrRの修飾に関わるRSSの代謝経路の決定：SqrRによる制御機構に寄与するRSS代謝系を明らかにするために、硫化水素を酸化してRSSを産生するメジャーな酵素であるSQRに着目して解析を行った。野生株とsqr遺伝子欠損株における硫化水素応答を観察したところ、sqrの欠損により、硫化水素添加後のSqrRの活性を恒常的に維持することができなくなった。れより、SQRはSqrRの制御に関わるRSSの恒常的な産生に寄与すると示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後も、以下の研究を構成することで、異なるアプローチによる研究成果を効率良く、有機的に結びつけることで研究の推進を図る。
1）細胞内のSqrRに対するRSSによる安定な修飾の種類の解明：SqrRはGSSHによってテトラスルフィド結合を形成することがわかっているが、CysSSHでも同様の修飾が形成されているかはわかっていない。さらに、硫化水素処理した細胞内での実際の修飾も解析できていない。そこで、CysSSH処理をしたリコンビナントSqrR、および、光合成細菌からアフィニティー精製したFLAGタグを融合したSqrRについて、質量分析によって修飾の種類を同定する。
2）SqrRの修飾に関わるRSSの代謝経路の決定：SQRが、SqrRの制御に関わるRSSの産生に関わることがかわったが、SQRによって産生されるRSSの実体は明らかでない。そこで、sqr欠損株におけるGSSHおよびCysSSHへの応答を観察することで、sqrの欠損によって減少したRSSの実体を明らかにする。また、リコンビナントSQRの酵素活性を測定することで、イオウ受容体となる分子の同定を試みる。また、RSS代謝の初期課程に関わる他の酵素についても、生化学的に酵素活性を測定し、RSS代謝への寄与を検証することで、より包括的なRSS代謝の理解を目指す。そのために、野生株とこれらRSS代謝関連遺伝子の欠損株について、質量分析を用いた網羅的RSS解析法によって細胞内RSSの定量を行うことで、細胞内のRSS代謝系の検証を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナの影響によって中止になった学会費用が余ったため、次年度使用額が生じた。次年度では、質量分析による解析で費用がかかるため、未使用額はその経費に充てることにする。
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