| 研究課題/領域番号 |
18K14659
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
石井 宏和 北海道大学, 電子科学研究所, 特任助教 (70743409)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 二光子顕微鏡 / 光操作 / ライブイメージング / 神経・グリア回路網 / オータプス |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、多点走査型2光子顕微鏡と2光子励起を用いたオプトジェネティクスの手法により、オータプス初代培養標本における神経・グリア回路網の活動伝搬様式を時空間的に可視化・解析する新規イメージング手法の構築を目的とする。
平成30年度では、まずオータプス初代培養標本の培養系・観察条件の最適化、遺伝子導入法の検証を行った。観察視野下に収まるような任意の範囲に複数のアストロサイトを島状に培養し、各アストロサイトアイランドに単一、もしくは複数の神経細胞を共培養した自己投射型の初代神経細胞を培養する系を確立した。アデノ随伴ウイルスベクターを用いて神経細胞にCa2+センサータンパク質を発現させ、オータプス初代培養標本における自発的な神経細胞内カルシウム濃度変動の伝搬様式を多点走査型2光子顕微鏡によりライブイメージングすることに成功した。
また細胞活動を光操作するため、多点走査型2光子顕微鏡に2種類の近赤外フェムト秒パルスレーザーを独立に観察試料に照射できる仕様とし、一方のビームを用いて任意の単一細胞を光刺激するための二光子励起光学系を構築した。
さらに、オータプス初代培養標本における活動伝搬や、それに伴ったスパインヘッドなどの超微細形態の変化を可視化するために、当研究室で開発した２光子STED顕微鏡の活用を試みた。その結果、固定サンプルではあるが、初代神経細胞におけるプレシナプスタンパク質Bassoonの局在を100 nm以下の空間分解能で観察することに成功した（論文投稿中）。オータプス初代培養標本の超解像ライブイメージングへの応用が期待された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成30年度は計画通りに、光刺激用光学系の構築、オータプス初代培養標本の最適化、プローブの選定、遺伝子導入法、観察条件の検討を行った。光刺激の条件検討については同年度中に完了する計画であったが、実際にはそこまで至らなかった。一方で２光子STED顕微鏡の活用など当初の計画以上に進んでいる部分もあり、研究計画全体としてはおおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
光刺激の条件検討を引き続き進める。オータプス初代培養標本の局所光刺激により特定の細胞を活性化させ、その活動が神経・グリア回路網を伝播する様式を包括的・時空間的にライブイメージング解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の計画よりも、血清など細胞培養関係試薬の使用を節約して研究を進めることができたため、物品費が減額した。また計上していた旅費については、本年度内に開催される学会にて成果発表するだけのデータを得られなかったため、次年度に繰越した。
次年度助成金については、細胞培養関係試薬、光学部品、イメージング用プローブなどの消耗品の購入に使用する。また成果発表のための旅費（FOM2019参加など）、論文投稿料に使用する。
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