| 研究課題/領域番号 |
18K14672
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
古田 芳一 北海道大学, 人獣共通感染症リサーチセンター, 講師 (40613667)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | DNAメチル化 / エピゲノム / メチローム / 制限修飾系 |
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| 研究実績の概要 |
バクテリアのゲノムにおけるエピジェネティック修飾は、大部分がDNAのメチル化によるものであり、真核生物同様、遺伝子発現制御や表現型に影響する事例が知られている。菌種間及び菌株間でゲノムのメチル化状態（メチローム）に大きな多様性があることから、メチロームの多様性が、ゲノムの多様性同様、バクテリアの表現型の多様化を引き起こし、菌種の適応進化に貢献すると考えられる。しかし、バクテリアのメチロームはあまりに多様であり、メチロームによる表現型変化の網羅的解析が困難であった。
本研究では、バクテリアのメチロームによる表現型の変化を網羅的に解析するため、ワンハイブリッド法を用いて、新たなターゲット配列を持つDNAメチル化酵素を開発し、10の5乗通り以上のゲノムのメチローム多様性を持つ大腸菌集団を作成する。メチロームの変化によって表現型が大きく変化した株を選択し、オーミクス解析によって、DNAメチル化によって制御される遺伝子を網羅的に検出する。DNAメチル化やプロモーターの位置、近傍遺伝子の発現量変化、DNA結合タンパク質の認識配列などの情報を統合し、バクテリアのエピゲノムによる遺伝子発現制御、表現型多様化の分子メカニズムを明らかにする。
平成30年度に新たなターゲット配列を持つDNAメチル化酵素の選抜を行うワンハイブリッド法を構築したので、令和元年度はこの手法を用いて選抜を実際に行った。選抜されたDNAメチル化酵素について活性を確認したところ、新たなターゲット配列に結合はするものの、DNAメチル化活性が確認されない酵素が観察された。そのため、メチローム多様性を補うため、ターゲット配列が既知のDNAメチル化酵素のクローニングを並行して進めている。その過程で、DNAメチル化酵素による表現型変化が見出されたので、分子メカニズムの解析を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
新たなターゲット配列を持つDNAメチル化酵素について、昨年度構築したワンハイブリッド法を用いて選抜を実施した。選抜されたDNAメチル化酵素についてPacBioシークエンサーを用いてDNAメチル化活性の解析を行った結果、新たなターゲットに結合するものの、DNAメチル化活性が確認されないものも観察された。そのため、ターゲット配列の多様性を補うため、ターゲット配列既知のDNAメチル化酵素のクローニングを並行して進めることとした。その過程で、DNAメチル化活性によって大腸菌の表現型が変化する事例が生じたので、その表現型変化のメカニズムについての解析も進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続きワンハイブリッド法およびターゲット配列既知のDNAメチル化酵素遺伝子のクローニングにより、多様なメチロームを持つ大腸菌ライブラリの構築を進める。また、DNAメチル化によって表現型が変化する事例について、メカニズムの詳細解析を進めていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ワンハイブリッド法によって選抜された株が当初予定より少なかったため、予定していたPacBioシークエンサーによる解析を一部次年度に行う必要が生じたため、その分を次年度使用額として計上した。
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