| 研究課題/領域番号 |
18K14680
|
|---|
| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
|---|
研究代表者 |
大字 亜沙美 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 基礎科学特別研究員 (50803417)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | クロマチン / 染色体 / 3Dゲノム / エピジェネティクス / ES細胞 / スクリーニング / 網羅的解析 |
|---|
| 研究実績の概要 |
近年、核内の三次元的なゲノム高次構造（3Dゲノム）解析を可能とするHi-C法が開発され、約100万塩基対の染色体ドメインTADの存在や、そのTADが転写活性の高いAコンパートメントと、低いBコンパートメントに空間的に分かれて核内に収納されていることが分かってきた。A/Bコンパートメント分布の制御は、遺伝子発現等のゲノム機能を調節する基盤になっていると考えられるが、コンパートメント形成の分子メカニズムは全く分かっていない。
我々は、3Dゲノム構造を反映するDNA複製時期制御に着目して研究を進め、DNA複製時期とコンパートメント分布がゲノムワイドに、しかも動的に相関していることを見出してきた。複製時期の早いゲノム領域はAコンパートメント、遅い領域はBコンパートメントとよく一致する。そこで、DNAの複製時期をGFPの蛍光強度によって可視化できれば、1細胞レベルでA/Bコンパートメント分布を推定でき、3Dゲノム制御機構へのアプローチが可能になると考えた。具体的には、マウスES細胞を用いて、コンパートメント分布を調べたいゲノム領域にGFP遺伝子を導入し、その複製状態（＝DNAコピー数）をGFP蛍光強度によって判定する。
本年度は、樹立したDNA複製時期レポーターES細胞株が実際に複製時期を検出し得ることを確認し、いよいよDNA複製時期の異常を引き起こす因子を同定すべく、CRISPR-gRNA全ゲノムスクリーニングを行った。この系の開発者である京都大学・遊佐宏介教授の協力の下、二種類のレポーターES細胞株について、GFP蛍光強度異常（＝DNA複製時期異常の可能性）を示す細胞群を濃縮し、その責任遺伝子の候補リストを得た。今後は、得られた候補遺伝子を個別に解析し、3Dゲノム制御への関与を検討する。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、GFP遺伝子を導入したレポーターES細胞株のGFP蛍光強度が、本当にDNA複製時期を反映するか否かの確認に時間を費やした。まず、複製時期の早いゲノム領域にGFP遺伝子を導入したES細胞株からGFP導入領域の複製時期が遅くなる変異細胞株を新たに樹立し、その細胞のGFP蛍光強度をフローサイトメーター (FACS) で測定した。その結果、変異なしの細胞株では細胞周期のS期後半にかけてGFP蛍光の上昇が見られたのに対し、変異細胞株では上昇が見られなかったため、GFP蛍光強度はDNA複製時期を反映していると結論づけた。
当初の計画では、ES細胞分化に伴うコンパートメント変化を制御する因子の同定を目指していたが、まず、未分化ES細胞でコンパートメント制御因子の同定を目指す方が合理的と考え、そのままCRISPR-gRNAスクリーニングへと実験を進めた。本スクリーニングは京都大学の遊佐宏介教授によって確立されたもので、CRISPR/Cas9システムを利用してマウスの全遺伝子を個別に破壊し、その中から特定の表現型を示す遺伝子変異を効率よく見出せる。例えば、DNA複製時期が早い領域にGFP遺伝子を導入したES細胞の場合、本来は細胞周期が進むにつれGFP蛍光強度は上昇するが、上昇が見られない細胞群には複製時期異常を引き起こす変異が入っている可能性が高い。この細胞群をFACSで回収し、次世代シークエンサーを用いて変異の入った遺伝子を同定すれば、複製時期制御に関わる候補因子のリストが得られ、この中にコンパートメント制御因子が含まれている可能性がある。現在、二種類のレポーターES細胞株でスクリーニングを終えており、今後はリストの上位遺伝子に着目して個別の表現型解析に移行する。
難航すると思われたスクリーニングが、遊佐教授の協力もありスムーズに終えられたため、おおむね順調に進展していると判断した。
|
| 今後の研究の推進方策 |
上記スクリーニングにより、DNA複製時期制御に関わるかもしれない候補因子が100遺伝子程度得られたため、効率的な二次スクリーニングを行って候補を絞っていく必要がある。具体的には、申請者が得意とするCRISPR/Cas9技術を駆使して、GFPレポーターES細胞株から、候補遺伝子を個別に破壊した変異細胞を作製する。変異細胞と、変異導入していない細胞とでGFP蛍光強度を比較し、細胞周期過程で蛍光レベルに違いが見られるかどうかをFACSによって観察する。本実験では、変異細胞を株化せずに細胞集団 (バルク) で観察するため、1週間程度で1遺伝子の解析を終えられる。しかも複数の遺伝子の解析を並行して進められるため、100遺伝子の解析も短期間 (1~2ヶ月) で終えられると予想している。GFP蛍光強度異常が再現できれば、そのまま変異細胞を全ゲノム複製時期解析へ持ち込み、GFPを導入した領域や、それ以外のゲノム領域における複製時期への影響を調べる。DNA複製時期異常を示していれば、いよいよ Hi-C法による核内コンパートメント解析を行い、候補遺伝子と3Dゲノムの関わりを調べる。以上のように効率よく実験を進めることで、残り1年でDNA複製時期および3Dゲノム制御因子の網羅的同定を達成できると考えている。
|
