1細胞DNA複製タイミング解析による発生分化過程の核内コンパートメント動態予測

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K14681
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 高橋 沙央里 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 基礎科学特別研究員 (80748856)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: DNA複製タイミング / 1細胞解析 / 細胞分化 / 初期胚発生 / 核内構造 / エピゲノム

研究実績の概要

近年開発されたHi-C法は、染色体ドメイン（TAD）や核内コンパートメントといったMb単位の階層のクロマチン構造をゲノムワイドに解析できる。この解析を個々の細胞で行うには1細胞Hi-Cを行う必要があるが、1細胞Hi-Cは解像度が低くコンパートメント分布の算出すら難しい。一方、我々は、哺乳類培養細胞を用いた1細胞ゲノムワイドDNA複製タイミング解析法scRepli-seqの開発に成功した。DNA複製タイミングの全ゲノムデータはコンパートメント分布と強く相関するため、scRepli-seqは1細胞でコンパートメント分布を推定できる強力な手法である。そこで、本研究では、マウスES細胞分化と初期胚発生に伴うscRepli-seqの経時的解析を行い、発生、分化に伴う三次元ゲノム構造変化を推定することを計画した。
前年度は、マウスES細胞分化に伴うscRepli-seq解析を達成することができたため（Miura et al, Nat Genet, 2019）、今年度は主にマウス初期胚でのscRepli-seq解析に取り組んだ。着床前胚を用いたscRepli-seq実験の条件検討を行い、現在までに4細胞期胚の1細胞DNA複製プロファイルを得ることができている。大部分のゲノム領域はES細胞と似た複製プロファイルを示したが、一部でES細胞と4細胞期胚で異なるプロファイルを示す領域も観察でき、これらの領域は核内コンパートメント分布も異なることが示唆された。現在は、初期胚発生とそれに伴う複製プロファイル変化に分化状態の情報を紐付けするために、同一細胞からのscRepli-seqとscRNA-seqを試みている。これにより、初期胚において受精後初の細胞分化がいつ起こり、その時の複製プロファイル変化、言い換えると核内コンパートメント変化がどのように起きるのかを、明らかにしたい。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

本研究では、(1) ES細胞分化誘導系におけるscRepli-seq解析と核内コンパートメント変化の推定、(2) 顕微鏡観察によるMid-S複製細胞の同定方法の確立、(3) 着床前胚のscRepli-seq、(4) 着床後胚における三胚葉分化に伴うscRepli-seq解析、を順に行うことを計画している。
前年度には(1)を達成しており、論文発表を行った（Miura, Takahashi et al, Nat Genet, 2019）。(2)については、得られた次世代シーケンスデータから、その細胞の細胞周期の時期を算出できることが判明し、必ずしもこれを行う必要がなくなった（Miura, Takahashi, Shibata et al, Nat Protocols, accepted）。そこで、今年度は(3)に取り組み、初期胚で再現性の高い1細胞scRepli-seqデータを出すための実験条件を決めることができた。この条件を用いて、4細胞期胚を継時的に回収し、回収時に胚を個々の細胞にばらして得られた１細胞を用いたscRepli-seq解析を行った。その結果、S期全体に渡って1細胞DNA複製プロファイルを得ることができ、初期胚細胞を用いた核内コンパートメント分布の予測が可能になりつつある。今後は、これに加えて、異なる発生ステージでの解析や、同一細胞からのscRNA-seq解析を組み合わせることで、初期胚発生に伴う複製プロファイルの変化を、分化状態の情報を紐付けしつつ明らかにすることを目指している。以上より、研究課題の進捗状況は、当初の計画以上に進展していると考えている。

今後の研究の推進方策

現在、マウス初期胚発生の過程で、どの分化状態の細胞が、どのような複製プロファイルを示すのかを明らかにするために、同一細胞からscRepli-seqとscRNA-seqを行う条件検討をしている。scRNA-seqについては理研BDR・二階堂研究室との共同研究を開始しており、彼らが開発したRamDA-seq（Hayashi et al, Nat Commun, 2018）技術を使用する。
これまでに、同一胚内の細胞を識別してscRNA-seqの詳細な解析を行った報告例はない。そこで、まず、全能性細胞から胎仔系列（ICM/epiblast）と胎盤系列（Trophectoderm）という2種類の細胞への受精後初めての分化が、どの発生ステージで起きるのかを、RamDA-seqによって検出することを目指す。次に、同一細胞からDNAとRNAを抽出し（現在、実験方法を条件検討中）、RamDA-seqで分化が確認された細胞についてscRepli-seqプロファイルがどのように変化しているのか、あるいは変化していないのかを解析する。
また、細胞集団を用いたHi-C解析を行った先行研究では、1細胞期から8細胞期胚において、ゲノム三次元構造が雌雄のアレルで異なり、それは発生に伴い解消されることが報告されている。しかし1細胞レベルで核内コンパートメント解析は行われていない。本研究ではF1ハイブリッドマウス胚を用いてscRepli-seqを行い、アレル間の複製タイミングに差異はあるのか、あるとしたらそれはいつ解消するのかを明らかにする。また、scRepli-seqではS期の進行時間の予測も可能であるため、その発生ステージ内のどの複製時期に変化が起こるのかを推定することも可能である。以上の解析を複数の胚発生ステージで行うことで、複製プロファイルが分化に伴いいつどのように変化するのか、その動態を明らかにする。

研究成果

• [雑誌論文] Single-cell DNA replication profiling identifies spatiotemporal developmental dynamics of chromosome organization (2019)
  • 著者名/発表者名: Hisashi Miura, Saori Takahashi, Rawin Poonperm, Akie Tanigawa, Shin-ichiro Takebayashi, Ichiro Hiratani
  • 雑誌名: Nature Genetics 巻: 51 ページ: 1356-1368
  • DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-019-0474-z
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Enhanced processivity of Dnmt1 by monoubiquitinated histone H3 (2019)
  • 著者名/発表者名: Yuichi Mishima, Laura Brueckner, Saori Takahashi, Toru Kawakami, Junji Otani, Akira Shinohara, Kohei Takeshita, Garvilles Ronald Garingalao, Mikio Watanabe, Norio Sakai, Hideyuki Takeshima, Charlotte Nachtegael, Atsuya Nishiyama, Makoto Nakanishi, Kyohei Arita, Kinichi Nakashima, Hironobu Hojo, Isao Suetake
  • 雑誌名: Genes to Cells 巻: 25 ページ: 22-32
  • DOI: 10.1111/gtc.12732
  • 査読あり
• [学会発表] Single-cell DNA replication sequencing and its application to studies of early mouse embryonic development (2019)
  • 著者名/発表者名: Saori Takahashi, Hisashi Miura, Takahiro Shibata, Koji Nagao, Chikashi Obuse, Shin-ichiro Takebayashi and Ichiro Hiratani
  • 学会等名: 第13回日本エピジェネティクス研究会年会
• [学会発表] 1細胞解析で明らかにされたDNA複製ドメインの細胞間の安定性と不均一性 (2019)
  • 著者名/発表者名: 高橋沙央里，三浦尚，柴田隆豊，長尾恒治，小布施力史，竹林慎一郎，平谷伊智朗
  • 学会等名: 第19回日本蛋白質科学会年会・第71回日本細胞生物学会大会合同年次大会
  • 招待講演
• [学会発表] マウスES細胞分化および初期胚発生過程における1細胞全ゲノムDNA複製タイミング解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 高橋沙央里，三浦尚，柴田隆豊，長尾恒治，小布施力史，竹林慎一郎，平谷伊智朗
  • 学会等名: 第42回日本分子生物学会年会
  • 招待講演