| 研究課題/領域番号 |
18K14698
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
内田 安則 神戸大学, 医学研究科, 助教 (80793603)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 脂肪酸 / 小胞体 / 脂質代謝 / カルシウム |
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| 研究実績の概要 |
小胞体は扁平なシートや曲率の高いチューブルなど、形態的に極めて異なる膜ドメインを持ち、この形態が機能発揮に重要である。小胞体形態形成の機構は、特定の膜構造を安定化する膜タンパク質（膜変形タンパク質）を中心に解析が進んでおり、脂質に着目した解析は進んでいない。小胞体は脂肪酸の伸長・不飽和化などの代謝反応が起きるオルガネラである。脂肪酸代謝は膜脂質の物性を変化させ、膜タンパク質の機能に影響を与える。このことから、脂肪酸代謝は膜変形タンパク質などの活性を変化させることで、小胞体形態に影響を与えると予想される。そこで本研究では、脂肪酸代謝酵素に着目し、小胞体形態形成との関連を明らかにする。
本年度は、脂肪酸伸長酵素の一つtrans-enoyl CoA reductase (TER) に着目した解析を行った。Strepタグを付けたTERを恒常的に発現する細胞を樹立した。その細胞抽出液からStrep-TERをpull downした。Pull downしたサンプルの中に約105 kDaのタンパク質 (p105) を見出した。質量分析の結果、p105は細胞内カルシウム動態に関わるタンパク質であった。バキュロウイルス発現系でTERおよびp105の組換えタンパク質を発現・精製し、結合実験を行った。その結果、両者は直接結合した。また、TERのC末端の細胞質領域がp105と結合した。
小胞体チューブルは細胞内カルシウムストアとして重要であり、カルシウム欠乏に伴って小胞体チューブルのリモデリングが起きることが報告されている。本年度の結果から、TERまたはTERが代謝する脂肪酸が、カルシウム制御を介して小胞体形態に関わる可能性が示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、TERの結合タンパク質としてp105を同定し、TERのC末端がp105と結合することを見出した。また、生化学的な解析に必須であるTER、p105の組換えタンパク質の発現・精製系を確立した。以前の報告から、p105がカルシウム動態に関わること、カルシウム動態が小胞体の形態制御に関わることが知られている。従って、TERがp105や膜変形タンパク質の機能を調節することで、小胞体形態に関わる可能性が考えられる。以上のように今後の研究の土台となる結果や、今後の解析に必要となるツールを得たことから、順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
1) 脂肪酸代謝による膜変形タンパク質の制御
まず小胞体膜形態に関与する脂肪酸代謝酵素・脂質分子種の探索を行う。具体的には、脂肪酸代謝酵素のノックダウンや阻害剤を用いてスクリーニングを行う。次に、小胞体形態において機能する脂肪酸・脂質分子種を同定するため、脂肪酸代謝酵素の発現抑制・阻害下で産物の脂肪酸・脂質を戻す実験も行う。この処理で小胞体膜形態の異常がレスキューできれば、加えた脂肪酸・脂質が膜形態においてクリティカルであると考えられる。その後、脂肪酸代謝酵素の発現抑制・阻害下で、膜変形タンパク質の発現量・局在や、膜変形に重要なオリゴマー形成を評価し、脂肪酸代謝が制御する膜変形タンパク質を同定する。ここでは、脂肪酸代謝によって制御される膜形態（チューブルまたはシート）に着目し、その形態に関与する膜変形タンパク質について解析を行う。
2) 脂肪酸を介した膜形態制御のリポソームでの再構成
解析で同定した「膜変形を制御する脂肪酸」と「脂肪酸代謝によって制御される膜変形タンパク質」を人工リポソームに再構成し、特定の脂肪酸を含む脂質分子によって膜変形タンパク質による形態形成が制御されることを示す。用いる脂質の脂肪酸組成や、膜変形タンパク質の種類・量を調節して最適化を行い、小胞体の形態形成について「脂肪酸と膜変形タンパク質の相互作用」も含めた新たなモデルを構築する。
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