| 研究課題/領域番号 |
18K14726
|
|---|
| 研究機関 | 北見工業大学 |
|---|
研究代表者 |
蔭西 知子 北見工業大学, 工学部, 研究員 (20815633)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | 免疫染色 |
|---|
| 研究実績の概要 |
アデノシン三リン酸（ATP）はエネルギー物質としてだけでなく、神経伝達物質としての機能が知られる。一方、植物の細胞外ATP受容体は哺乳類に比べ20年程遅れて報告された。植物の細胞外ATP受容体DORN1は哺乳類とは異なり、膜に存在するキナーゼ様受容体の一つであること、エンドサイトーシスによって膜に局在するということがわかっているが、植物での細胞外ATPの働きとシグナリング経路および受容体DORN1の作用機序について謎が多い。興味深いことに、DORN1はレクチンキナーゼ様受容体LecKI.9ドメインを有することが知られており、LecKI.9は植物の細胞壁と細胞膜の接着に関係することが予想されている。申請者はこれまでに細胞外ATPが根の重力屈性を制御することを見出したことから(未発表)、植物のATP受容後のDORN1による、細胞壁－細胞膜間の接着制御に着目している。本研究では、細胞外ATPシグナリングの経路を解明するために、ATPや細胞外ATP受容体DORN1を蛍光ラベルし、ライブイメージングでの細胞外ATPシグナリング経路の解明を目的とした。
令和元年度の研究では、細胞外ATP受容体DORN1の細胞の局在とエンドサイトーシスをはじめとした膜輸送によるリアルタイムな挙動を明らかにするために、細胞外ATP受容体DORN1のクローニングを行い、蛍光タンパク質を融合させたシロイヌナズナ組換え体の作成を開始した。また、ライブイメージングでは観察が不可能である、ネイティブなDORN1の局在を免疫染色法で観察するために、シロイヌナズナの抗DORN1ポリクローナル抗体の作成を完了した。この植物組織の凍結切片試料作成のために必要となるクライオトームなど環境の整備をはじめ、必要なプロトコルの確立を行なった。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
平成30年度の秋に申請者の妊娠が判明したことから体調を考慮して学会や研究会、国際学会への参加など、令和元年度まで計画していた学会や研究会への参加を全て控えたことと、令和元年６月から令和２年３月まで申請者が育休を取得したため進捗は遅れている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
今後は植物の細胞外ATPの放出経路解明のために細胞内外ATPをラベルする方法を探索し、ライブイメージングでその観察を順次実施する。具体的には、まず（１）植物のどの組織から細胞外ATPが活発に放出されるか、ルシフェリン、ルシフェラーゼ反応といった化学発光法を利用し、観察する。（２）細胞内外のATPの局在をATPに結合することが知られる蛍光色素キナクリンでラベルし、その後、膜輸送に関わる阻害剤を使用して、ATP小胞の分泌経路を観察する。（３）細胞内外のATPセンサーとして哺乳類で知られる蛍光タンパク質遺伝子をシロイヌナズナなど植物に組み込んで、細胞レベルでのATP分泌の動きを捉え、植物の細胞外ATPに新しい知見を与える予定である。以上の計画のうち（２）、（３）では特に宇都宮大学の共焦点レーザー顕微鏡による観察を申請時に予定していたが、平成30年11月に申請者が北見工業大学に異動したことで、予定していた共焦点レーザー顕微鏡を使用できなくなった。そこで本年度は、東京農業大学北海道オホーツクキャンパスが保有する共焦点レーザー顕微鏡の使用許可の承諾を受け、研究再開後にすぐ、共焦点レーザー顕微鏡を使用し、上記のすべての研究に取り掛かる予定である。
さらに植物の細胞外ATP受容体DORN1タンパク質に存在する植物レクチンキナーゼ様受容体による、細胞壁－細胞膜の接着制御の仕組みの謎に迫るために植物の細胞外ATP受容体DORN1の局在を観察する予定である。令和元年度にDORN1抗体の作成を完了させたことから、来年度の研究では、植物の凍結切片に対して免疫染色を行い、植物の屈性や伸長領域に局在するDORN1の観察を実施する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
申請者の所属の異動により、研究に主に使用を予定していた共焦点レーザー顕微鏡を使用できなくなった。そのため共焦点レーザー顕微鏡を使用するために購入を予定していた試薬や、手法を慎重に再検討する必要が出た。現在は、共焦点レーザー顕微鏡の使用を主としない研究手法を検討している。現在申請者は組織切片の免疫染色や透過型電子顕微鏡、HPLC-MS、GC-MS、ESRなど申請者がこれまでに使用したことのない機器が利用できる環境に異動となったため、今後はそれら機器を利用して研究を遂行する計画を立て始めている。また、所属外の機関に共焦点レーザー顕微鏡の共同利用の申し込みを行う予定であり、そのための旅費や使用料といった経費に次年度使用額を使用させていただく計画である。
また、申請者が平成30年度の秋に妊娠し、令和元年３月まで育児休暇を取得したことで、体調を考慮して学会や研究会、国際学会への参加などを控えることとなり、計画していた旅費が大幅に次年度使用額となった。令和２年度は初めての育児への不安はあるが、平成30年度に計画していた学会、国際学会、研究会への積極的な参加を計画している。
|
