| 研究課題/領域番号 |
18K14734
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
吉田 英樹 名古屋大学, 生物機能開発利用研究センター, 特任助教 (10814353)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 転写制御因子 / プロテオミクス / 成長制御 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題においてはbiotin化ターゲットペプチド領域を付加したdCas9、biotin化酵素およびguideRNAをイネ葉肉細胞由来protoplastに一過的に発現させ、そこからタンパク質-DNA複合体を抽出し、streptavidinによってprecipitationを行った後、精製産物をMSで解析することで、特定のゲノムDNA領域上に結合しているタンパク質を網羅的に特定する実験系を確立すること、そして、それによってイネの成長制御に関わる転写制御因子を網羅的に解析することを目的としている。現在までに、dCas9およびbiotin化酵素をprotoplast内で安定的に発現させるコンストラクトについて検討を行い、様々なpromoter配列やdCas9遺伝子を比較検討した結果、トウモロコシのユビキチンのpromoterとイネのcodonに最適化したdCas9遺伝子を用いることでdCas9を安定的に発現させることができた。また、同時にdCas9のbiotin化についても条件検討を行っており、dCas9を発現させるplasmidとbiotin化酵素を発現させるplasmidをco-transfection後、biotin入りのバッファーで48時間インキュベートしたprotoplastにおいて、biotin化されたdCas9をwestern blottingによって検出することができた。このインキュベートの条件は先行研究の条件と一致していた。この成果はイネ葉肉由来protoplastが溶液中のbiotinを取り込むことができることを示し、またdCasに付加したbiotin化ターゲットペプチド領域のbiotin化において適切な溶液中のbiotin濃度を決定できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
研究代表者の異動に伴い実験を2度に渡り中断せざるをえなかったことから、当初よりも研究計画は遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、biotinを付加したdCas9のprecipitationの条件検討を行ったうえで、実際にguideRNAも含めてtrasnfectionしたprotoplastを用いて、MS解析を行う予定である。その後、検出された転写制御因子について分子生物学、遺伝学的解析を行い、その因子の生理学的機能を明らかにする。
また、本研究により蓄積したbiotin化酵素や目的タンパク質の人為的なbiotin化に関する知識をもとに、CAPTURE法以外の特異的biotin化を必要とする実験についても検討を行いたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究代表者の異動に伴い実験を2度に渡り中断せざるをえなかったため当初よりも研究計画が遅れたことにより、次年度使用額が生じた。今年度は昨年度までに実行できなかった実験、およびそれを発展させた実験を行う予定である。
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