|
本研究課題においてはbiotin化ターゲットペプチド領域を付加したdCas9、biotin化酵素およびguideRNAをイネ葉肉細胞由来protoplastに一過的に発現させ、そこからタンパク質-DNA複合体を抽出し、streptavidinによって免疫沈降を行った後、精製産物をMSで解析することで、特定のゲノムDNA領域上に結合しているタンパク質を網羅的に特定する実験系を確立すること、そして、それによってイネの成長制御に関わる転写制御因子を網羅的に解析することを目的としている。現在までに、dCas9およびbiotin化酵素をprotoplast内で安定的に発現させるコンストラクトについて検討を行い、様々なpromoter配列やdCas9遺伝子を比較検討した結果、トウモロコシのユビキチンのpromoterとイネのcodonに最適化したdCas9遺伝子を用いることでdCas9を安定的に発現させることができた。また、同時にdCas9のbiotin化についても条件検討を行っており、dCas9を発現させるplasmidとbiotin化酵素を発現させるplasmidをco-transfection後、biotin入りのバッファーで48時間インキュベートしたprotoplastにおいて、biotin化されたdCas9をwestern blottingによって検出することができた。このインキュベートの条件は先行研究の条件と一致していた。この成果はイネ葉肉由来protoplastが溶液中のbiotinを取り込むことができることを示し、またdCasに付加したbiotin化ターゲットペプチド領域のbiotin化において適切な溶液中のbiotin濃度を決定できた。しかし、実際にCAPTURE法を行うための免疫沈降はうまくいかなかった。
|
