| 研究課題/領域番号 |
18K14738
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| 研究機関 | 基礎生物学研究所 |
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研究代表者 |
金澤 建彦 基礎生物学研究所, 細胞動態研究部門, 助教 (60802783)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | オルガネラ / 膜交通 / 分泌経路 / ゼニゴケ / 油体 |
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| 研究実績の概要 |
真核細胞に存在する単膜系オルガネラは、物質輸送機構「膜交通」により、タンパク質や脂質、多糖類が正確に輸送・局在化される。新規オルガネラ獲得に伴い、輸送経路の開拓があったと考えられるが、その進化過程に膜交通がどのように関与したのかについての知見は乏しい。本研究課題では、陸上植物の系統特異的オルガネラ獲得とその進化過程に膜交通がどのように関与したかを明らかにすることを目指し、苔類特異的なオルガネラである油体を新規獲得オルガネラのモデルとして、ゼニゴケの油体発生と膜交通の関与、植物の系統特異的オルガネラ獲得の共通モジュールの解明を目指している。
これまでの研究により、油体形成時には、転写発現を伴った一過的な輸送経路の再配向が起こること、その輸送経路の再配向がたった1つの転写因子により制御されている可能性が高いことを明らかにしてきた。
そこで本研究課題では輸送経路の再配向の分子を同定するため、油体形成転写因子変異体のRNA-Seqのデータから逆遺伝学的に輸送経路の再配向スイッチ分子の探索を行った。さらにこの転写因子の発現誘導系を用いて、油体形成誘導系を構築した。この誘導系を用いた解析から、油体形態形成において特定の細胞骨格の関与が示唆されたが、輸送経路再配向は、細胞骨格非依存的である可能性が示唆された。また、油体と油体細胞の大きさには、正の相関がみられることから、輸送経路の再配向は、細胞が成長していく過程の中で、その経路の切り替えを繰り返し行っていることが考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
油体形成マスター転写因子の機能獲得変異体および機能欠失変異体を用いたRNA-Seqの結果から、136遺伝子がこの転写因子の下流遺伝子群候補であると考えられた。これら遺伝子の一部についてqRT-PCRを実施し、RNA-Seqのデータとの強い正の相関を得ることができた。また、油体マーカーとしてこれまで用いていたMpSYP12Bもこの136遺伝子に含まれており、これと同様の挙動を示す遺伝子の一部については蛍光タンパク質融合のコンストラクトを用いたライブイメージングを行った。これらは油体細胞特異的に発現することが明らかになり、油体形成マスター転写因子により制御される遺伝子群が油体細胞で特異的に機能することがより強く支持された。
野生型植物の内在性の油体形成は、その発生頻度が低いため、油体形成の誘導系の確立および誘導系による油体形成過程の観察を試みた。まずマスター転写因子の誘導系の条件検討を行った。熱誘導プロモーターを用いた一過的な誘導処理では、油体発生は限定的にしか起こらなかった。一方、エストラジオールを用いた構成的誘導条件では、誘導後約15時間で油体マーカーのシグナルが観察され始め、処理後24時間で油体様構造の形成がほぼ全ての細胞で観察された。そこで、エストラジオールを用いた転写因子の誘導系を、油体形成誘導系とした。この油体形成誘導系を用いて、細胞骨格形成阻害剤による細胞骨格と油体形成の関係について観察を行ったところ、特定の細胞骨格の形成阻害剤処理により、油体の断片化が生じたことから、油体の形成には特定の細胞骨格が重要な役割を果たしていることを示唆する知見を得ている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究は、新規オルガネラ獲得における輸送経路の再配向機構の解明であり、そのモジュールに関する知見を得ることで、陸上植物の新規オルガネラ獲得機構を明らかにすることを目指している。現段階で輸送経路の再配向を実行する分子が未同定であるため、今後はそこに注力する。
油体形成誘導系の処理後1時間おきにサンプリングを行いqRT-PCRを行った結果、誘導後比較的早いタイムポイントで転写誘導が生じるものと、比較的遅いタイムポイントで転写誘導が生じるもの2パターンに分類できた。前者は油体マスター転写因子の直接の標的であり、後者は別のシステムを介して転写活性化が起こるものと考えられる。後者が発現する際には既に輸送方向の再配向が生じていたことから、輸送方向の再配向のスイッチ分子は前者、すなわち油体マスター転写因子により直接制御されている分子である可能性が強く考えられる。この前者が発現するタイムポイントで、転写上昇が見られる遺伝子群に解析の対象を絞り込む。これら遺伝子群の中には、パラログの存在するもの、相互作用が予測されるものが存在したため、それらの多重変異体を作出しており、今後その変異体における輸送異常の観察を行うことで、輸送経路の再配向に関わる遺伝子の最小セットの同定を目指す。
油体形成誘導系では、油体だけではなく、多くのオルガネラや細胞骨格がダイナミックに変化していることが示唆されたため、誘導条件下での細胞骨格や各種オルガネラマーカーの可視化ラインを作出中であり、今後詳細な観察を行う。最終的には、誘導系で見られたシステムが内在のものを反映しているのか、より詳細な検証を行う。
さらに、油体形成マスター転写因子を同定した時と同じ順遺伝学的スクリーニングによる探索も並行して進めている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度では、油体マスター転写因子とその下流因子の多重変異体を用いたRNA-Seq解析を行う予定であったが、油体形成誘導系の確立により、解析対象を絞り込む方法を当初の実験計画から変更したため、RNA-Seq解析分の経費を繰り越し、次年度に実施する計画に変更した。
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