新規三次元解析法による海馬神経ネットワーク形成におけるApc遺伝子の機能解明

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K14843
• 研究機関: 藤田医科大学
• 研究代表者: 尾之内 高慶 藤田医科大学, 共同利用研究推進施設, 講師 (20632954)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: APC / 海馬 / 神経ネットワーク / 組織透明化法

研究実績の概要

Adenomatous polyposis coli (APC)は、大腸癌抑制遺伝子として同定された因子である。APCは大腸のみならず脳にも多く発現しているが、脳におけるAPCの機能はよく分かっていない。本研究では、癌が発生しない変異APC(APC1638T)を発現するAPC1638Tマウスの海馬神経ネットワークを調べて、海馬神経ネットワーク形成におけるAPCの機能を明らかにする。
2018年度は、Linear Slicerを購入して、4%パラホルムアルデヒドで固定した野生型APCマウスの厚さ100μm, 300μm, 1000μmの脳組織切片(前頭断)を作製して、組織透明化法(SeeDB2法)の性能を確認した。その後、蛍光免疫染色に使用予定の神経細胞マーカー抗体(NeuN抗体, MAP2抗体)やAPC結合タンパク抗体(PSD-95抗体, チューブリン抗体)の最適蛍光免疫染色条件(抗原賦活条件, 抗体希釈条件)の検討を行った。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

2018年度の研究計画では、1.Linear Slicerの購入、2.脳組織切片の作製、3.組織透明化法(SeeDB2法)の性能の確認、4.神経細胞マーカー抗体とAPC結合タンパク抗体の最適蛍光免疫染色条件の検討、5.透明化処理した野生型APCマウスとAPC1638Tマウスの海馬組織切片に対して、神経細胞マーカー抗体を用いた蛍光免疫染色を行う、神経細胞の三次元構造解析、6.透明化処理した野生型APCマウスとAPC1638Tマウスの海馬組織切片に対して、APC抗体とAPC結合タンパク質抗体を用いた蛍光免疫染色を行う、APCとAPC結合タンパク質の三次元局在解析を行う予定であった。
神経細胞マーカー抗体とAPC結合タンパク抗体の最適蛍光免疫染色条件の検討に苦戦したため、5.透明化処理した野生型APCマウスとAPC1638Tマウスの海馬組織切片に対して、神経細胞マーカー抗体を用いた蛍光免疫染色を行う、切片深部の神経細胞の三次元構造解析、6.透明化処理した野生型APCマウスとAPC1638Tマウスの海馬組織切片に対して、APC抗体とAPC結合タンパク質抗体を用いた蛍光免疫染色を行う、切片深部のAPCとAPC結合タンパク質の三次元局在解析を行うことができなかった。

今後の研究の推進方策

2019年度は、透明化処理した野生型APCマウスとAPC1638Tマウスの海馬組織切片に対して、神経細胞マーカー抗体を用いた蛍光免疫染色を行う、切片深部の神経細胞の三次元構造解析を行う。その後、透明化処理した野生型APCマウスとAPC1638Tマウスの海馬組織切片に対して、APC抗体とAPC結合タンパク質抗体を用いた蛍光免疫染色を行う、切片深部のAPCとAPC結合タンパク質の三次元局在解析を行う。さらに、1枚の切片の同じ場所を共焦点レーザー顕微鏡と走査型電子顕微鏡で観察するという光-電子相関顕微鏡法を用いて、野生型APCマウスとAPC1638Tマウスにおける海馬神経細胞の三次元微細構造解析、APCとAPC結合タンパク質の三次元微細局在解析を行う。

次年度使用額が生じた理由

実験に使用する試薬の中で定価より安かったものがあったため、次年度使用額が生じた。
次年度に行う実験に必要な試薬・実験器具に充てる。