| 研究課題/領域番号 |
18K14883
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| 研究機関 | 滋賀医科大学 |
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研究代表者 |
日比野 絵美 滋賀医科大学, 神経難病研究センター, 特任助教 (00803371)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | アルツハイマー病 / NMR / ILEI / プレセニリン-1 |
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| 研究実績の概要 |
ILEIはγセクレターゼの構成分子の一つであるプレセニリン-1へ結合することでAβの産生を抑制することが報告されている。その分子機構を明らかにし、アルツハイマー病治療薬の開発へつなげることが本研究の目的である。
・相互作用の生物物理化学的解析 : ILEIの相互作用に関わる領域をNMRによって同定するために、本年度はILEIの大腸菌発現系ならびに精製法を確立し、CDスペクトルやNMRスペクトルの測定を行なった。1H-15N HSQCスペクトルを測定したところ、比較的分散したスペクトルが得られた。そこで、ILEIの1H-15N HSQCスペクトルによりILEIとの相互作用を解析した結果、プレセニリン-1のC末端ペプチドとは相互作用が見られなかった一方で、細胞から調製した膜画分中にILEIと相互作用する分子の存在が示唆された。
・培養細胞を用いた評価系 : ILEIに導入した変異の効果を評価する系を構築した。HEK293 ILEI KO細胞にAPPとILEIを共発現させる系において、Aβ40の産生量をELISAにより定量することで、ILEIの効果が評価できることを確認した。また、Aβ40の産生量に関与するILEIの領域を特定するために変異体系列を作製した。
・3D-RISM理論に基づいた計算 :プレセニリン-1のDQL配列と結合する可能性のあるILEIの領域を3D-RISMに基づく計算により絞り込むことができた。また、プレセニリン-1のDQL配列に限定しない1μsのドッキングシミュレーションにより、γセクレターゼに結合する場合の構造の候補を挙げることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ILEIの発現系と精製法の構築において、大腸菌、プラスミドの種類、タグの種類および位置、また発現時の条件など検討事項が多かったものの、NMR測定に耐えうる量が得られる系を確立することができた。また、培養細胞を用いた評価系の構築も完了できた。ただ、プレセニリン-1と結合するILEIの領域を特定することはできなかった。一方で、膜画分中に存在する分子と結合するILEIのピークを確認することができた。
3D-RISM理論に基づく計算も行なったが、培養細胞で確認したところ、Aβ産生量に大きく関わる残基の特定にまでは至らなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
膜画分中に存在する分子が結合する残基を特定するために、ILEIのNMRスペクトルの帰属を完了させる。また、膜画分試料ではILEIとγセクレターゼの結合に予期しない影響がある可能性が排除できないため、精製γセクレターゼ複合体を用いて詳細な解析を行う。さらに、膜画分中にこれまでに知られていない新たな結合分子が存在する可能性があるため、研究計画には含めていなかったが、作用機序のさらなる理解のためにその分子の同定を進める。
また、ILEIの機能評価系を用いて、Aβ産生に関与するILEIの残基を特定する。その結果を３D-RISM理論に基づく計算をはじめとする計算系に適用し、結合時のILEIの構造を決定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
溶液NMR測定用サンプルの調製のために必要な高額な試薬の使用量が今年度計画よりも少なく、次年度使用額が計画よりも多くなった。次年度は今年度よりNMRサンプル用の試薬を多く購入する予定である。また、細胞培養やAβ量の測定のためのELISA kitの購入に多くを充てる予定である。
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