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本研究の目的は、CRISPR/Cas9システムによる遺伝子ノックアウト系およびCRISPR/Cas9システムの変法である遺伝子発現活性化系を使用したゲノムワイドスクリーニングにより、遺伝子ノックアウトまたは過剰発現で日本脳炎ウイルスに耐性を示す宿主因子を同定することである。スクリーニングにより同定された遺伝子群について機能解析を行うことで、日本脳炎ウイルスの感染に関わる宿主因子の網羅的同定および機能の解明を目指す。
昨年度までに遺伝子ノックアウト系および遺伝子発現活性化系それぞれについて、日本脳炎ウイルス感染による細胞死を指標としたゲノムワイドスクリーニングを行った。その結果、日本脳炎ウイルス感染なしのコントロールと比較して過剰に検出されたsingle guide RNA (sgRNA)が複数得られた。本年度はこれらのsgRNAに対応する遺伝子を日本脳炎ウイルスのライフサイクルに関わる宿主因子および同ウイルスの感染に抵抗性を示す抗ウイルス作用を持った宿主因子の候補として解析を行った。遺伝子ノックアウト系で得られた候補遺伝子については、オフターゲット作用による細胞死への耐性ではないことを確認するために、CRISPR/Cas9システムを用いて遺伝子ノックアウト細胞を作製した。遺伝子発現活性化系で得られた候補遺伝子については、オフターゲット作用による細胞死への耐性ではないことを確認するために、クローニングしたcDNAを細胞に導入して過剰発現細胞を作製した。これらの候補遺伝子ノックアウト細胞および候補遺伝子過剰発現細胞に日本脳炎ウイルスを感染させ、細胞の生存率を指標として同ウイルスへの耐性を評価したところ、オフターゲット作用であったと考えられる候補遺伝子もいくつかあったが、日本脳炎ウイルスの感染に関わる宿主因子であると考えられるものが複数得られた。
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