2018 年度実施状況報告書

細胞内GTP量制御を用いた新規細胞膜透過性制御機構の開発

研究課題

研究課題/領域番号	18K14989
研究機関	日本薬科大学
研究代表者	瀧沢裕輔日本薬科大学, 薬学部, 講師 (40453807)
研究期間 (年度)	2018-04-01 – 2021-03-31
キーワード	Guanosine triphosphate / Tight junction / IMPDH inhibitor / Mycophenolic acid / Paracellular pathway
研究実績の概要	本研究では消化管からの薬物の新規吸収制御機構として、細胞内Guanosine triphosphate (GTP)量の変化によるTight junction (TJ)の制御の可能性に着目し研究を展開している。これまでに本研究の基礎となる知見を基に、GTP生成のde novo経路において律速酵素であるInosine-5’-monophosphate dehydrogenase (IMPDH)の阻害剤であるMycophenolic acid (MPA)によるTJ開口作用の確認を、ヒト結腸癌由来上皮細胞のCaco-2細胞を用いて行った。しかしながら先行論文の結果に反して、TJ開口の指標となる経上皮膜間抵抗値(TEER)は、MPAの作用時間 (24, 48, 72, 96 hr)および濃度 (1, 10, 100 μM)依存的な低下は認められず、逆に上昇が認められた。MPA添加によりTEERが上昇していることから、TJが制御因子である細胞間隙経路を介する薬物の透過性には変化が認められなかった。MPA添加による細胞内GTP量をHPLCにより測定したところ、1および10 μM MPA添加96時間後のみの限定的な条件での結果だが、MPAの濃度依存的な減少を確認している。MPAによるTEER上昇機構の解明のために、TJ構成因子の1つであるClaudin family (Claudin-1, Claudin-2, Claudin-4)の発現変動をWestern blottingにより解析しているが、有意な変化は認められていない。Claudinの発現変動に関してもMPA添加96時間のみの検討となっているので、さらなる条件での検討が必要である。上述の本研究で得られているMPAによるTEER上昇は、先行論文の結果に対して真逆の結果となっていることから、本実験結果の整合性を確認するために、MPAと同様のIMPDH阻害作用を有するMizoribine (MZB)を用いて検討を行ったところ、MPAの結果と同様にTEERの低下は認められず、上昇を確認している。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由 MPAによるIMPDH阻害条件下でのTJ (TEER)の変化を検討したが、研究計画発案当初の想定結果とは真逆の結果が得られたことから、本来は使用予定のなかったMZB添加条件の検討を行ってはいるものの、TEERの測定や薬物の膜透過実験に関して、研究コンセプトが真逆にはなってしまっているが、研究そのものは概ね順調に遂行できていると言える。一方で、HPLCによる細胞内ヌクレオチド定量法の確立に時間を要したが、現在はATPとGTPの同時定量条件を確立している。しかしながら、細胞内GTP量の変化によるTJの変化には、GTP以外の他のヌクレオチドの変化も重要な因子となりうることからも、現在はAMP、ADP、GMP、GDPの同時定量法の設定を行っている。
今後の研究の推進方策	本研究の基礎となった報告と真逆の実験結果が得られているが、本研究の目的はTJ開閉による細胞感激経路透過性の制御であることから、コンセプトを逆転させ、細胞内GTP量の増加によるTJの開口と、細胞内GTPの減少によるTJの閉口の可能性を検討予定である。そのためには、MPAとMZBで見られたTEERの上昇効果の機構解明のために、XMPからGMPへの反応を触媒するGMP synthaseを阻害するAcivicinを用いて再検討を行うことで、細胞内GTP量の減少によるTEER上昇の裏付けするデータの収集を行う。さらに、TJ機能制御を担っていると報告されているPhosphorylatable myosin light chainの存在量や、細胞内に複数種存在するヌクレオチドの量および存在比等を検討し、機構解明を試みる。一方で、MPAによるTEER上昇効果、すなわちTJの再構築促進効果の可能性が認められていることから、病態時におけるTJの開口を、MPA添加（IMPDH阻害）による抑制の可能性が考えられる。そこで、TJの開口が認められる低酸素モデルや、LPS誘発炎症モデル、活性酸素による脂質過酸化モデル棟を構築し、MPAによる障害抑制効果（障害保護効果）の検討を行う予定である。
次年度使用額が生じた理由	想定していた結果が得られなかったため、購入を控えた試薬が複数あったため。