| 研究課題/領域番号 |
18K15009
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| 研究機関 | 関西医科大学 |
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研究代表者 |
大江 総一 関西医科大学, 医学部, 助教 (70599331)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 脳梗塞 / 胆汁酸 / CYP7A1 / 低酸素 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題は、脳梗塞領域に出現する胆汁酸を「脳由来胆汁酸」と捉え、その合成メカニズムと生理機能を明らかにする事により新規脳梗塞治療法確立を目指している。令和元年度（平成31年度）は、梗塞脳における胆汁酸標的細胞の同定とその作用機序の解析を実施した。中大脳動脈の外科的焼灼・凝固術により完全梗塞モデルマウスを作製し、胆汁酸合成経路にかかわる酵素群の免疫組織化学染色をおこなった。その結果、脳梗塞領域のNeuN陽性ニューロンにおいて胆汁酸合成酵素群（CYP7A1、HSD3B7、CYP27A1、CH25H）が発現することを明らかにした。一方、GFAP陽性のアストロサイトは梗塞領域内には観察されず梗塞領域周囲、特に脳梁領域に局在していたが、これらのアストロサイトは胆汁酸合成酵素群を発現していなかった。また、CC1陽性のオリゴデンドロサイト、Iba1陽性のミクログリアにおいてもこれらの酵素群の発現は認められなかった。次に、脳由来胆汁酸が作用しうる標的細胞を同定するために胆汁酸受容体（TGR5、FXR）の免疫組織化学染色をおこなった。その結果、TGR5がGFAP陽性のアストロサイトにおいて発現することが認められた。また、細胞内への胆汁酸取り込みにかかわるトランスポーター（ABST、NTCP）の免疫組織化学染色を行った結果、ASBTはほとんど発現が認められなかったが、NTCPはニューロンにおける発現が認められた。これらの結果から、梗塞領域においてニューロンによって合成された胆汁酸が周囲のニューロンおよびアストロサイトに作用しうることが示唆された。また、中大脳動脈の遮断・再灌流による虚血/再灌流モデルマウスを作製し同様の解析を行った結果、ニューロンでの胆汁酸合成酵素群の発現が認められ、脳由来胆汁酸の出現は二つの異なる脳梗塞モデルに共通する現象であることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題の実施状況について、令和元年度（平成31年度）は胆汁酸合成を担う細胞種および標的細胞の同定をおこなっており、当初の計画通り脳由来胆汁酸の生理機能の解析を遂行している。加えて、計画立案時には脳梗塞モデルマウスに対しin vivoマイクロダイアリシスを用いた胆汁酸注入と脂質除去能の解析を予定していたが、施術による組織障害が細胞動態に大きく影響したため、代替手法として胆汁酸の皮下投与による体内胆汁酸プール増加を実施し梗塞領域での脂質除去能解析を進めている。また、令和元年度、令和2年度において胆汁酸シグナル不活性化マウスの作製を予定していたが、ニューロンにおける胆汁酸受容体（TGR5）およびトランスポーター（NTCT）の発現が認められたためニューロン特異的CYP7A1ノックアウトマウスを作製することで胆汁酸シグナル不活性化マウスとして解析を進める。現在、CRISPR/Cas9システムを用いたノックアウトマウス作製のための発現ベクター構築等に着手している。これらの状況を考慮し、本研究課題はおおむね順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和2年度以降の研究については当初の計画どおりに進める。すなわち、「脳特異的胆汁酸シグナル不活性化マウスの作製と解析」を実施する。具体的には、Nestin-CreマウスとCYP7A1-loxPマウスによりニューロン特異的な胆汁酸合成不全マウスを作製する。このような胆汁酸シグナル不活化マウスにおいて脳梗塞手術を施し、24時間後におけるアストロサイト活性化状態、梗塞容積、記憶学習に関する行動などを評価し、個体レベルでの脳由来胆汁酸シグナルの生理作用を明らかにする予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究計画では当該年度内に、脳梗塞領域での胆汁酸可視化、律速酵素CYP7A1発現細胞の同定、CYP7A1発現変化の解析等の結果をまとめ英文生命科学雑誌にて発表する事を目指しておりその英文校正費、投稿費を計上していた。実際には、胆汁酸合成を担う細胞種同定の詳細な結果を加えることでより質の高い内容になると判断し投稿を延期したため、投稿に係る費用の一部が次年度使用額として発生した。次年度は英文生命科学雑誌にて発表するための費用として使用する。
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