| 研究課題/領域番号 |
18K15009
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| 研究機関 | 関西医科大学 |
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研究代表者 |
大江 総一 関西医科大学, 医学部, 助教 (70599331)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 脳梗塞 / 胆汁酸 / CYP7A1 / 低酸素 / ニューロン / 発現制御 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題は、脳梗塞領域に出現する胆汁酸を「脳由来胆汁酸」と捉え、その合成メカニズムと生理機能を明らかにする事により新規脳梗塞治療法確立を目指している。令和2年度は、梗塞脳における胆汁酸合成メカニズムの解明を行った。これまでに中大脳動脈の外科的焼灼・凝固術による完全梗塞モデル、および中大脳動脈の遮断・再灌流による虚血/再灌流モデルの両モデルマウスにおいて、免疫組織染色法により胆汁酸合成律速酵素であるCYP7A1の発現上昇を確認していることからその発現メカニズムに着目した。そのためにCYP7A1遺伝子の転写活性を明らかにするためルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイ（Lucアッセイ）を行った。CYP7A1転写開始点の上流約500bpのプロモーター領域を用いてLucアッセイを行ったところ、肝がん由来細胞株HepG2細胞では高い転写活性を示し、神経芽細胞種Neuro2a細胞では低い転写活性を示した。さらにこれらの細胞を用いて脳梗塞病態のin vitroモデルである低酸素低グルコース負荷実験を行ったが、転写活性に変化は見られなかった。CYP7A1転写開始点の上流約3000bpのプロモーター領域を用いてLucアッセイを行った場合でも同様の結果であり、脳梗塞状態でのCYP7A1発現上昇は転写活性の亢進によるものではないことが示唆された。また脳梗塞領域のニューロンでの発現上昇を示すHSD3B7のプロモーターを用いたLucアッセイにおいても同様の結果が得られた。現在はCYP7A1、HSD3B7のmRNA安定性制御に着目して発現上昇メカニズムの解析を行っている。また、胆汁酸合成不全マウス作製を進めており、今後、このマウスにおいて脳梗塞手術を施し、24時間後におけるアストロサイト活性化状態、梗塞容積、記憶学習に関する行動などを評価し、個体レベルでの脳由来胆汁酸シグナルの生理作用を明らかにする。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究課題の実施状況について、令和2年度は胆汁酸合成不全マウスの解析を予定していたが当初の計画より遅れており、現在、CRISPR/Cas9システムを用いた遺伝子改変マウス作製を進めている。一方で、計画立案時には想定していなかった脳梗塞病態における胆汁酸合成酵素の発現メカニズムが明らかとなりその詳細な分子機構を解析している。これらの状況を考慮し、本研究課題はやや遅れていると判断する。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和3年度の研究については主に胆汁酸合成不全マウス作製とその解析を行う。具体的には、Nestin-CreマウスとCYP7A1-loxPマウスによりニューロン特異的な胆汁酸合成不全マウスを作製する。このマウスにおいて脳梗塞手術を施し、24時間後におけるアストロサイト活性化状態、梗塞容積、記憶学習に関する行動などを評価し、個体レベルでの影響を明らかにすることで、脳梗塞病態における胆汁酸シグナリングの意義を明らかにすることができると考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究計画では令和2年度内に、脳梗塞領域での胆汁酸可視化、律速酵素CYP7A1発現細胞の同定、CYP7A1発現変化の解析、胆汁酸合成不全マウス作製と行動解析などの結果をまとめ英文生命科学雑誌にて発表する事を目指しており、その英文校正費、投稿費を計上していた。実際には、胆汁酸合成不全マウスの作製・解析がやや遅れているため、投稿に係る費用の一部が次年度使用額として発生した。令和3年度は英文生命科学雑誌にて発表するための費用として使用する。
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