| 研究課題/領域番号 |
18K15024
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| 研究機関 | 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター、アストロバイオロジーセンター、生命創成探究 |
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研究代表者 |
宇治澤 知代 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター、アストロバイオロジーセンター、生命創成探究, 生命創成探究センター, 特別協力研究員 (10816515)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | TPRチャネル / 温度プローブ |
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| 研究実績の概要 |
温度感受性TRPチャネルの活性化温度閾値は膜電流とパッチクランプされた細胞近傍の溶液温度の同時計測から決定されている。しかし、細胞外からの熱刺激による細胞内温度、さらにはTRPチャネルが発現する形質膜付近の温度が実際にどのように変化しているのかはわかっていなかった。今回、細胞内温度を計測できる1励起2蛍光型の蛍光温度プローブ(gTEMP)を用いて、細胞内温度と細胞膜電流の同時計測を行いたい。そのために、パッチクランプの装置に細胞内蛍光シグナルイメージング装置を組み合わせたシステムを構築した。この同時計測システム上で、蛍光温度プローブと温度感受性TRPチャネルを強制発現させたHEK293T細胞の解析をおこなう。
まず、温度感受性TRPチャネルとしては、温度依存的な電流が最も安定して観察できるrat TRPV1を選択した。同時計測システムを構築後、rat TRPV1のみを強制発現させたHEK293T細胞から熱刺激に対する正常なチャネル応答がとらえられることを確認した。つぎに、HEK293T細胞へのgTEMPの導入方法、さらに、gTEMPを強制発現させたHEK293T細胞の1励起2蛍光の画像撮影条件の検討をおこなった。また、rat TRPV1とgTEMPを共発現させたHRK293T細胞においてもrat TRPV1の熱応答を得られたことから、gTEMPがチャネルの活性に影響を与えないことを確認した。現在は、同時計測システムにおいてgTEMPの温度依存的なレシオ値のキャリブレーションを試みている。条件が整い次第、rat TRPV1とgTEMPを共発現させたHEK293T細胞を用いて、実際に同時計測を行いたい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
パッチクランプの装置に細胞内蛍光シグナルイメージング装置を組み合わせた後、この装置上でrat TRPV1を強制発現させた細胞から、これまでに報告されてきたrat TRPV1の熱応答が正確にとれるように機器の調整を行った。次に細胞内温度プローブのキャリブレーションに取り掛かった。プローブが1励起2蛍光であるため、それぞれに対して適切な露光時間などの撮影条件を検討する必要があった。上記のようにチャネルの応答または温度プローブの蛍光変化を別々には計測できる条件を整えたが、同時に計測しようとした場合、パッチクランプされた細胞が蛍光画像撮影中に動き、正確な蛍光強度変化を得ることができなかった。
上記の通りシステムの動作確認とキャリブレーション作業、そして同時計測しようとした場合の問題点の解消に時間を要しため、温度感受性TRPチャネル活性と細胞内温度の同時計測という実験系の確立までは完了することができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
パッチクランプされた細胞が溶液灌流の条件下で動いてしまうことを最小限に抑えられる撮影条件を検討する。さらに、IRレーザーを使用した熱刺激方法の検討も進める。IRレーザーは共焦点顕微鏡に搭載されているため、まず共焦点顕微鏡にパッチクランプシステムを組み合わせる。また、温度プローブの発現量が細胞間で異なることがレシオの値のばらつきにつながり、温度プローブのキャリブレーション作業の問題点となっていると考えられたため、これまで一過性発現の細胞を使用していたところを定常発現株に変更し、これを用いて解析をおこなう。HEK293細胞を用いてチャネルと細胞内温度の同時計測が可能になったのち、初代培養細胞を用いた同様の実験を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初予定していた実験計画よりも進捗が遅れたため、使用する予定であった実験器具の購入に至らなかった。
次年度では、共焦点顕微鏡を使用した解析を開始するため、それに伴う備品の購入、または、初代培養細胞の単離と培養に伴う実験機器の購入を検討している。
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