胎児発育不全の予防を目指したユビキチン転移酵素CNOT4の生理機能の解明研究

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18K15038
• 研究機関: 秋田大学
• 研究代表者: 山口 智和 秋田大学, 医学系研究科, 助教 (30749940)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: CNOT4 / ユビキチン転移酵素 / 胚発生 / 細胞増殖

研究実績の概要

CNOT4による分子制御機構の解明のため、令和元年度は下記の項目を検討した。
1) CNOT4 floxed マウスの作製：組織特異的なCNOT4遺伝子欠損の表現型解析のため、CRISPR/CAS9ゲノム編集によりCNOT4 floxedマウスを作製した。開始コドンを含むExon2の上流、及びExon3下流のイントロン領域を標的とするgRNAを設計し、loxP配列を含むssODN、CAS9 Nucleaseと共にマウス受精卵に顕微注入後、個体化を行った。得られたCnot4flox/floxマウスをCreTg/+マウスに交配後、産子マウス組織におけるCNOT4の消失をウェスタンブロットにて検出した。
2)CNOT4欠損MEFの表現型解析：Cnot4flox/flox; CAG-Cre/Esr1Tg/+マウス同士の交配後、受精後13.5日の胎児からMEFを単離した。タモキシフェン添加によりCNOT4の欠損を誘導したところ、添加後2日で細胞増殖の低下を認めた。さらに、FACS解析の結果、CNOT4の欠損により細胞死(PI染色)陽性細胞の有意な増加を認めた。この結果から、CNOT4が細胞の増殖や細胞死抑制に重要であることがわかった。
3)CNOT4によるmRNA制御の解析： HEK293T細胞におけるCNOT4遺伝子の発現抑制は胚発生関連遺伝子の発現を減少させることが、前年度のRNAseq解析により明らかとなった。RIP解析の結果、その中でも細胞増殖に重要なgeneXがCNOT4に強固に結合していることがわかった。さらに、CNOT4のRNA認識ドメイン欠損体ではその結合が消失しており、CNOT4の発現抑制はgeneX mRNAの安定性を低下させたことから、CNOT4はgeneX mRNAに結合し安定的に発現を維持することで細胞増殖や胚の発生に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。

研究成果

• [雑誌論文] B38-CAP is a bacteria-derived ACE2-like enzyme that suppresses hypertension and cardiac dysfunction (2020)
  • 著者名/発表者名: T. Minato, S. Nirasawa, T. Sato, T. Yamaguchi, M. Hoshizaki, T. Inagaki, K. Nakahara, T. Yoshihashi, R. Ozawa, S. Yokota, M. Natsui, S. Koyota, T. Yoshiya, K. Yoshizawa-Kumagaye, S. Motoyama, T. Gotoh, Y. Nakaoka, J. M. Penninger, H. Watanabe, Y. Imai, S. Takahashi, K. Kuba
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 11 ページ: 1-12
  • DOI: 10.1038/s41467-020-14867-z
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Essential functions of the CNOT7/8 catalytic subunits of the CCR4-NOT complex in mRNA regulation and cell viability (2020)
  • 著者名/発表者名: Mostafa Dina、Takahashi Akinori、Yanagiya Akiko、Yamaguchi Tomokazu、Abe Takaya、Kureha Taku、Kuba Keiji、Kanegae Yumi、Furuta Yasuhide、Yamamoto Tadashi、Suzuki Toru
  • 雑誌名: RNA Biology 巻: 17 ページ: 403～416
  • DOI: 10.1080/15476286.2019.1709747
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The CCR4-NOT Deadenylase Complex Maintains Adipocyte Identity (2019)
  • 著者名/発表者名: Takahashi Akinori、Takaoka Shohei、Kobori Shungo、Yamaguchi Tomokazu、Ferwati Sara、Kuba Keiji、Yamamoto Tadashi、Suzuki Toru
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 20 ページ: 5274～5274
  • DOI: 10.3390/ijms20215274
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 圧負荷心不全におけるCNOT6L脱アデニル化因子の抗線維化作用の解明 (2020)
  • 著者名/発表者名: 山口智和、佐藤輝紀、湊隆文、安健博、星崎みどり、渡邊博之、今井由美子、山本雅、久場敬司
  • 学会等名: 第93回日本薬理学会年会
• [学会発表] 心不全病態モデルマウスにおけるmRNA poly(A)制御、翻訳制御の生理機能の解明 (2019)
  • 著者名/発表者名: 山口智和、佐藤輝紀、中岡慎治、久場敬司
  • 学会等名: 2019年度「先進ゲノム支援」拡大班会議
• [学会発表] Protective roles of CNOT6L deadenylase in pressure overload-induced cardiac remodeling (2019)
  • 著者名/発表者名: Tomokazu Yamaguchi, Teruki Sato, Takafumi Minato, Jianbo An, Midori Hoshizaki, Hiroyuki Watanabe, Yumiko Imai, Tadashi Yamamoto, Keiji Kuba
  • 学会等名: The 50th NIPS International Symposium
  • 国際学会
• [学会発表] CCR4-NOT脱アデニル化因子による心臓リモデリング抑制作用の解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 山口智和、佐藤輝紀、湊隆文、安健博、星崎みどり、渡邊博之、今井由美子、山本雅、久場敬司
  • 学会等名: 第29回日本循環薬理学会
• [学会発表] 肥満組織におけるCNOT4ユビキチンリガーゼの生理機能解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 山口智和、佐藤輝紀、夏井美幸、星崎みどり、山本雅、今井由美子、久場敬司
  • 学会等名: 第92回生化学会大会
• [学会発表] 細胞増殖制御におけるユビキチン転移酵素CNOT4の機能解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 山口智和
  • 学会等名: 第7回CCR4-NOT研究会
• [学会発表] CCR4-NOT 複合体によるAtg7 依存性細胞死の阻害と心臓の恒常性維持 (2019)
  • 著者名/発表者名: 山口智和、鈴木享、佐藤輝紀、高橋明格、山本雅、今井由美子、久場敬司
  • 学会等名: 第83回 日本生化学会 東北支部例会