| 研究課題/領域番号 |
18K15054
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
高橋 剛 公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, 研究員 (70802817)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | CRISPR-Cas12a / CRISPR-Cpf1 / Amplicon Sequencing / Lentiviral Library |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、CRISPR-Cas12a（CRISPR-Cpf1）を用いたゲノム編集により、遺伝子ノックイン不要の高精度、高正確性をもつ欠失変異導入法を確立することを目的とする。我々は、Cas12aが切断部位に5'突出末端を形成することに着目して、2箇所の標的配列の切断後に生じる突出末端を相補的とすることで、ダブルカット後の末端同士が結合することによる正確な欠失変異導入が可能であることを見出した。本年度は、昨年度に引き続き、Cas12aでのダブルカットによる正確な欠失導入を特徴づけるため、アンプリコンシーケンスによる詳細な解析を進めた。また、新たな目標として突出末端の配列の組み合わせによる影響を明らかとするための実験系の立ち上げを進めた。アンプリコンシーケンス解析では、昨年度までの結果から一部のガイドRNAで活性が低いことが判明したため、追加のガイドRNAを新たに設計して、データを追加した。突出配列の影響を明らかとする実験系においては、ダブルカットによって形成される突出配列がランダムとなる人工標的配列をもつレンチウイルスライブラリを作製した。このライブラリを用いて、HEK293T細胞のゲノム上に人工的な標的配列を作り出すことに成功し、さらに突出配列に相当する部分がランダムな配列となっていることが確認された。また、試験的な段階ではあるものの、実際にCas12aを発現させてダブルカットを誘導し、作り出した人工的な標的配列を編集することにも成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
Cas12aダブルカットの条件抽出に注力したため、当初予定していた疾患モデルiPS細胞でのCas12aダブルカットによるエキソンスキッピングが実施できていない。ダブルカットによる条件はおおむね傾向が得られているため、本年度はiPS細胞での検証を進める予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
アンプリコンシーケンスによって得られたCas12aのダブルカットの条件を、疾患モデルiPS細胞で実際に実施する。モデルiPS細胞には筋ジストロフィー症モデルを用い、Cas12aのダブルカットによるエキソンスキッピングによって、疾患からの回復を狙う。また、ダブルカットの際に形成される2つの突出末端について、配列が影響するかを調査するため、可能な限り解析を進める。研究期間内に配列の影響を解析できた場合は、最適な突出末端配列となる条件を反映したガイドRNAを設計することで、より正確かつ再現性の高いゲノム編集技術の開発を進めたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度の助成金の多くは、アンプリコンシーケンス解析のための試薬類の購入に使用し、多少の残額が生じた。次年度使用額については、合算して利用し、引き続き必要な試薬類の購入に充てる予定である。
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