2018 年度実施状況報告書

細胞膜受容体CKAP4のエクソソームへの輸送メカニズムと生理機能の解析

研究課題

研究課題/領域番号	18K15064
研究機関	大阪大学
研究代表者	木村公一大阪大学, 医学系研究科, 特任助教(常勤) (60595370)
研究期間 (年度)	2018-04-01 – 2020-03-31
キーワード	CKAP4 / DKK1 / エクソソーム
研究実績の概要	細胞膜上のタンパク質がエクソソームへ輸送および分泌される機構として、細胞膜上のタンパク質がエンドサイトーシスされ、多胞性エンドソームにリクルートされた後、開口放出される経路が知られており、タンパク質毎に、エクソソームへの輸送・分泌に関与する複数の遺伝子が報告されている。細胞膜上に発現するCKAP4はDKK1が結合することでクラスリン依存性エンドサイトーシスをうけ、上述の経路にのってエクソソームへ移行する。CKAP4のエクソソームへの移行の最初のステップにDKK1およびクラスリン依存性エンドサイトーシスが必要である。それ以降のCKAP4のエクソソームへの輸送機構を明らかにするため、CKAP4が細胞膜上に高発現、かつエクソソーム中に高発現する膵がん細胞株であるS2-CP8細胞において、エクソソーム形成や分泌に関与することが知られている10種類の遺伝子（endosomal sorting complex required for transport with the associated proteins であるTSG101、HRS、およびALIX、tetraspanin proteinsであるCD9、CD63、およびCD81、small G proteinであるRab27aおよびRab27b、 vacuole sorting proteinであるVPS26aおよびVPS35)をsiRNAによりノックダウンし、エクソソーム中CKAP4の発現量を比較した。その結果、配列の異なる2種類のsiRNAによるノックダウンでALIX、Rab27a、Rab27b、VPS26a、およびVPS35の5種類がCKAP4のエクソソームへの移行に重要であることが明らかとなった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由本研究では二年間の研究期間で、① CKAP4のエクソソームへの輸送メカニズム、②エクソソーム中CKAP4の生理機能を明らかにすることを目的としている。初年度は、① CKAP4のエクソソームへの輸送メカニズムに関して、膵がん細胞株S2-CP8細胞においてエクソソーム形成や分泌に関与することが知られている複数の遺伝子をsiRNAでノックダウンすることで、CKAP4のエクソソームへの移行・分泌に必要な5種類の遺伝子（ALIX、Rab27a、Rab27b、VPS26a、およびVPS35）を明らかにすることができた。すなわち、細胞膜上に発現するCKAP4にDKK1が結合し、クラスリン依存性のエンドサイトーシスをうけた後に、エクソソームへ移行・分泌される際に必要である遺伝子が明らかとなった。以上より、おおむね順調に進展していると判断した。
今後の研究の推進方策	当初の研究計画を継続しながら、得られた研究成果を基に以下の解析を行っていく。 1）膵がん細胞株S2-CP8細胞においてCKAP4のエクソソームへの移行・分泌に必要であった5種類の遺伝子（ALIX、Rab27a、Rab27b、VPS26a、およびVPS35）が、他の細胞株でも同様に、CKAP4のエクソソームへの移行・分泌に必要であるか検討する。２）CKAP4のエクソソームへの移行の最初のステップにDKK1およびクラスリン依存性エンドサイトーシスが必要であることを明らかにしている。また、DKK familyタンパク質であるDKK3がDKK1と同様にCKAP4に結合し細胞増殖を促進すること、エンドサイトーシスを誘導することを明らかにしている。以上の結果から、DKK1のみならず、DKK3依存性エンドサイトーシスもCKAP4のエクソソームへの移行を促進することを明らかにする。具体的にはDKK3および細胞膜上CKAP4高発現株において、DKK3を発現抑制することで、エクソソーム中CKAP4の発現が低下することを明らかにする。３）エクソソーム中CKAP4の生理機能について解析する。S2-CP8細胞のCKAP4過剰発現株とCKAP4ノックアウト株の培養上清から、エクソソームを精製する（以下、CKAP4過剰発現エクソソームとCKAP4非発現エクソソーム）。精製したエクソソームによりCKAP4が低発現であるがん細胞株を刺激することで、CKAP4過剰発現エクソソームがCKAP4非発現エクソソームに比べて有意に遊走能（トランスウェルを用いたアッセイ）、浸潤能（マトリゲルコートされたトランスウェルフィルターを用いたアッセイ）を亢進するか否かを検討する。
次年度使用額が生じた理由	研究計画が順調に進んでおり、当該年度に消耗品を新たに買う必要が無くなったため。今年度から生化学的解析用の試薬や免疫不全マウスが必要であり、消耗品費として使用する予定である。