| 研究課題/領域番号 |
18K15091
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| 研究機関 | 獨協医科大学 |
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研究代表者 |
石井 順 獨協医科大学, 医学部, 助教 (80749599)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 肺癌 / 神経内分泌形質 / Delta-Notch / 小細胞肺癌 |
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| 研究実績の概要 |
肺癌細胞の神経内分泌形質発現にDLK1が与える影響を解析するに当たり、まず種々の組織型に由来する肺癌細胞株における、DLK1を含めたDelta-Notchファミリー分子の発現をRT-PCR法で確認した。Deltaリガンドのうち、神経内分泌形質を有する小細胞肺癌株はDLL1およびDLL2、DLL3、DLK1を高発現する傾向がみられ、中でもDLK1は小細胞肺癌以外の株では発現がほとんどみられず、高い発現特異性を示した。Notchレセプターの発現に関しては、小細胞肺癌株でやや低い傾向がみられたが、細胞株間の発現差はDeltaリガンドほど顕著でなかった。PCR結果の裏づけをとるため、肺癌細胞株のDLK1タンパク発現をウエスタンブロット法により解析すると、小細胞肺癌株ではDLK1発現を示すシグナルが検出された一方、非小細胞肺癌株では検出されなかった。以上の発現解析から、小細胞肺癌細胞におけるDLK1の発現特異性が明らかにされた。DLK1を高度に発現する小細胞肺癌株としてTKB15およびTKB16、Lu135を、DLK1発現の低い非小細胞肺癌株としてA549およびTKB5、H1299細胞などを選別し、遺伝子導入/発現抑制実験に用いることとした。
DLK1遺伝子をCRISPR-Cas9システムにてノックアウトするため、検索ツール等を用いてガイドRNA配列を設計し、ガイドRNAとCas9タンパクを発現するプラスミドを構築した。プラスミドをTKB15に導入してクローニングし、DLK1をノックアウトしたTKB15細胞を得た。また、DLK1遺伝子をクローニングして発現ベクターを構築し、非小細胞肺癌に導入して安定発現株を得た。遺伝子発現の変化はウエスタンブロット法で確認した。現在、作製した細胞株を用いての遺伝子発現解析を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
種々の組織型に由来する肺癌細胞株におけるDelta-Notch関連遺伝子の網羅的発現解析から、DLK1の小細胞癌細胞における発現特異性が明らかにされ、研究対象分子として有意義であろうことが再確認された。またDLK1遺伝子のノックアウト株および強制発現株が樹立され、研究を進める上での重要なツールが揃いつつある。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究実施計画に従い、DLK1遺伝子発現を変化させた細胞における神経内分泌関連遺伝子の発現解析を行う。小細胞肺癌の細胞株は、in vivoでの様態と異なり一般に増殖速度が遅く、遺伝子ノックアウト等の作業には時間を要し容易ではないが、根気よく取り組む。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
理由：本年度に作製した培養細胞を用いた遺伝子発現解析、並びに培養細胞実験を継続するため、次年度使用額が生じた。
使用計画：1. 遺伝子発現解析用試薬の購入、2. 細胞培養用培地・血清・消耗器具の購入、3. DLK1陽性細胞を選別するためのプラスミドベクター作製にかかる試薬・消耗品の購入、4. 細胞を特殊な状況（ゲル包埋など）で培養するための消耗品の購入
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