| 研究課題/領域番号 |
18K15119
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
竹中 菜々 京都大学, iPS細胞研究所, 特別研究員(RPD) (20792849)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | iPS細胞 / ウルリッヒ型筋ジストロフィー症 / 細胞移植治療 / 間葉系前駆細胞 / 6型コラーゲン / 骨格筋再生 / 骨格筋成熟 |
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| 研究実績の概要 |
骨格筋組織中には血小板由来増殖因子受容体（PDGFRα）陽性の間葉系間質細胞（MSC）が存在している。MSCが産生し分泌する様々な成長因子や細胞外基質は、骨格筋の恒常性の維持や筋再生にポジティブに働いていることが報告されている。それらMSCが産生する細胞外基質の中でも、6型コラーゲン（COL6）は、筋肉幹細胞（サテライト細胞）の自己複製や骨格筋再生を促進すると報告があり、ヒトでは、COL6の欠損はウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー症(UCMD)等の筋疾患の原因となることが分かっている。UCMDは、全身の骨格筋の萎縮と筋力低下が主な病態であるが、現時点で有効な治療法は存在しておらず、そればかりか、COL6の欠損がどのようなメカニズムを介してUCMDの病態を引き起こしているかについても明らかとなっていない。
研究者はこれまで、UCMDモデルマウスに対して、ヒトiPS細胞から作製されたMSC (iMSC)を移植する実験を実施し、移植されたiMSCが生着し、正常なCOL6を分泌すること、そして、COL6が補充された領域において、サテライト細胞が活性化され、それとともに再生筋の成熟が促進されることでUCMDの病態が改善することを、組織学的な解析により確認した。
そこで、COL6産生能力を欠落させたiPS細胞（COL6KO-iPSC）と、UCMD患者由来細胞から作成されたiPS細胞からMSCを誘導し、前述の実験と同様にUCMDモデルマウスへ移植し、治療効果を解析することで、細胞移植によるUCMD治療メカニズムを解明することを目的として、当該研究を計画した。この研究は「なぜCOL6が欠損すると筋委縮が起こるか」を精緻に解析することにもつながり、UCMD発症メカニズムの解明に寄与し、治療法開発にもつながる
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
令和元年度は、in vitroの実験をメインに進めた。iMSCとCOL6KO-iMSCをそれぞれ、UCMDモデルマウスの骨格筋より採取した筋サテライト細胞と共培養し、3日後にサテライト細胞の増殖・分化の解析を実施した。さらに10日後には、サテライト細胞から分化した筋管細胞の成熟過程の解析も実施した。その結果、iMSCとの共培養時には、骨格筋サテライト細胞の増殖・分化・成熟の促進効果が確認されたが、その一方で、COL6KO-iMSCとの共培養時には、それらの現象はほとんど確認されなかった。これらの結果は平成30年度に実施されたin vivoでの移植実験結果と一致しており、iMSCから分泌されるCOL6に、骨格筋再生成熟を促進する効果があることを裏付ける結果となった。
続いて、共培養開始6日後のサテライト細胞を全て収集し、骨格筋分化、筋芽細胞融合、筋成熟に関連した遺伝子の発現量の解析を実施した。その結果でも、iMSCと共培養したサテライト細胞では、COL6KO-iMSCと共培養したものと比較して、筋分化、筋芽細胞融合、成熟に関連した遺伝子発現が有意に高いことが示された。
令和元年度の前半は、前年に出生した第二子の育児により時短勤務という勤務形態をとらざるを得ず、さらに年度末には新型コロナウイルス感染防止対策のために在宅勤務をすることとなったために、当初の実験計画から遅れが発生したことにより、予定していたRNA-seqによる解析実験は年度内に実施できなかった。しかしながら、それ以外の実験は問題なく実施でき、論文としてデータをまとめられたために、論文投稿まで進めることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、「COL6による骨格筋再生・成熟促進メカニズム」について、より詳細を明らかとするための分子学的解析を実施して、治療効果を発揮している因子を具体的に判明させることを考えている。
これまでのvivo実験とvitro実験により、COL6KO-iMSCではUCMD モデルマウスに対して治療効果が得られないことが明らかとなったため、iMSC移植による治療効果は、「iMSCによって分泌されるCOL6を介した作用」が関与している可能性が高いと考えた。そのため、サテライト細胞との共培養実験を実施したのち、共培養3日目に、①RNA seq、②シグナルリン酸化解析を実施し、サテライト細胞の活性化に、COL6がどういった因子やシグナル経路を介して関与しているかを明らかとする。これらin vitro実験により、COL6がUCMD筋に対して治療効果を発揮する際に関与する具体的な因子を、骨格筋の分化ステージごとに詳細に解明することができる。同時に、in vivo解析では、hiPSC-MSCまたはCOL6KO-hiPSC-MSCが移植されたUCMDマウス筋組織を採取し、それぞれに対してサイトカイン抗体アレイ解析を実施して比較する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2018年末に次女を出産したことに伴い、産後休暇と育児休暇取得のために、研究中断期間(6か月)が発生した。さらに、研究活動の再開後も次女が哺乳瓶での哺乳が困難であり、勤務時間を短縮せざるを得ず、当初の計画から大きく遅延することとなり、研究費の未使用額が発生した。
次年度には、2019年度中に実施予定であったRNA-seqによる解析実験を実施予定であり、そのために未使用額を使用することを考えている。
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