| 研究課題/領域番号 |
18K15143
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
尾花 望 筑波大学, 医学医療系, 助教 (00722688)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | Ribonulcease / Clostridium / degradosome / virulence factor |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではクロストリジウム属細菌におけるRNA切断・分解を介した病原性因子の制御機構の詳細を明らかにする。ウェルシュ菌において主要なリボヌクレアーゼ（RNase Y）はRNAの切断・分解を介して付着活性やバイオフィルム形成、毒素遺伝子発現に重要な役割を担っている。
本年度はRNase Yの切断ターゲットRNA配列をゲノムワイドに決定するため、末端依存的エキソ型RNase処理したTotal RNAを用いたRNA-seq解析を行った。末端依存的エキソ型RNase処理によってRNAの5´末端が切断末端であるか否かを判別することが可能である。RNase Yノックダウン時に発現が変動しつつ、且つ末端依存的エキソ型RNaseで処理した際に発現量が減少する遺伝子群を抽出することにより、RNase YによるmRNA切断依存的に発現が制御される遺伝子の同定を目指した。解析の結果、既存のRNase Y切断末端であるpilA2遺伝子が抽出できたことから、本方法によって候補遺伝子の探索が可能であることが示された。
また、ウェルシュ菌におけるデグラドソーム（RNA分解酵素複合体）複合体の相互作用および細胞内局在を解析するための蛍光タンパク質レポーター株の作製のため、本菌における適切な蛍光タンパク質を探索した。複数種の蛍光タンパク質をウェルシュ菌内で発現させ、細胞内における蛍光量および局在性を解析した結果、コドン出現頻度をウェルシュ菌用に改変した赤色蛍光タンパク質が蛍光観察には適当であることが明らかとなった。
さらに、デグラドソームに関与する遺伝子群のウェルシュ菌ホモログ遺伝子の破壊株の作製に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
RNase Yによる切断のターゲット遺伝子候補の抽出に成功したことから、おおむね当初の計画通り研究が進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
RNA-seq解析によって抽出した候補遺伝子について、詳細な発現解析およびRNA切断面の同定を行う予定である。
また、今年度作製した蛍光タンパク質コンストラクトを応用し、様々なデグラドソーム構成タンパク質の細胞内局在を観察する。
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