| 研究課題/領域番号 |
18K15144
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
楠屋 陽子 千葉大学, 真菌医学研究センター, 特任助教 (50711149)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | Aspergillus fumigatus / 銅 / 銅ホメオスタシス / RNA-seq / 遺伝子発現比較 |
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| 研究実績の概要 |
銅は生命維持に欠かせない必須金属であるが、その濃度は低くすぎると生育が阻害され、高すぎると毒となる。病原性真菌Aspergillus fumigatusにおいても銅の獲得と解毒が宿主内での生存に重要な役割を果たしている。そこでA. fumigatusの銅ホメオスタシスの転写制御機構を調べることで、銅ホメオスタシス関連因子の探索とその機能解明を通して、どのようにして宿主内で環境適応し、病原性を保ち感染拡大に至るのかを明らかにすることを目的とする。
平成30年度は、A. fumigatusの銅ホメオスタシスの転写制御を担っている転写因子Afmac1またはaceAを破壊した株を用いてRNA-seq解析を行い、A. fumigatusの銅ホメオスタシスに関与する因子の検索を行った。転写因子Afmac1は、環境中の銅濃度が低い時に銅を獲得するための遺伝子の発現を誘導する事から、銅をキレートする試薬を添加した銅欠乏条件を用い、転写因子aceAは、環境中の銅濃度が高い時に細胞内の銅濃度を下げるための遺伝子の発現を誘導する事から、硫酸銅（CuSO4）を添加した銅過剰条件でそれぞれ菌体を培養、回収した。RNA-seqのためのライブラリーは、500 ngのRNAを使用して、New England BiolabsのNEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation ModuleとNEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illuminaにより調整した。調整したライブラリーをHiSeq2500（Illumina）で解析し、得られたデータをTrinityやSAMtools等を用いて最終的にRPKMを算出した。RPKMから遺伝子発現の比較を行い、銅ホメオスタシスに関与する因子の候補を見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
課題開始前に転写因子Afmac1またはaceAを破壊した株の作成を終えており、培養条件の検討等も半分程進めていたので、RNA-Seqの解析は順調に進み、ライブラリー調整および次世代シーケンサー、HiSeq2500（Illumina）による解析も、これまでに何度も経験していたため、A. fumigatusの銅ホメオスタシスに関与する因子の候補を探索することができたが、それぞれの転写因子AfMac1またはAceAのC末にタグを付加した株の作成に苦戦している。その為、それらの株を使ったChIPに関する実験を進めることができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
RNA-seqのデータ解析により得られた銅ホメオスタシスに関与する因子の候補に関して、CRISPRを用いて破壊株の作成を行う。間に合えばこれらの株と野生株（Af293）、転写因子Afmac1またはaceA破壊株をそれぞれマウスに感染させる感染実験を計画している。感染したマウスから肺を摘出し、肺から抽出したRNAをマウス由来とA. fumigatus由来に分け、感染時に発現量が上昇している遺伝子の抽出を試みる。これにより感染時に必要とされる宿主とA. fumigatus双方の銅ホメオスタシスに関与する遺伝子情報が得られると予想する。また、CRISPRを用いることでA. fumigatusの形質転換が以前よりも簡便になった事から、転写因子AfMac1またはAceAのC末へのタグの付加をCRISPRにより挑戦する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
RNA-seqのライブラリー調整、次世代シーケンサーHiSeqの試薬等の購入を予定していたが、他の研究者が行うHiSeqに相乗りすることができたため、試薬の購入をする必要が無くなった。ChIPを行うための株の作成が遅れているためChIPに必要な試薬、抗体等の購入をしていないために予定額に満たなかった。
作成の遅れている株の作成を今まで使っていなかった手法であるCRISPRを使って行うため、CRISPRに必要なガイドRNAやCas9タンパク、試薬等の購入を行う。
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