| 研究課題/領域番号 |
18K15155
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| 研究機関 | 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構 |
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研究代表者 |
長瀬 里沙 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 研究員 (60768034)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ピロリ菌 / CagA |
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| 研究実績の概要 |
近年の研究からピロリ菌cagA遺伝子陽性株感染と胃がんとの密接な関連が明らかとなり、胃がん発症機序への理解や胃がん治療への応用にCagAの発がん活性発現における分子機構の解明が重要な意義を持つものと期待されている。これまでに、CagAを介する胃がんの発症においてCagA-SHP2複合体形成によるSHP2チロシンホスファターゼの機能的脱制御が重要な役割を果たすことが示されている。本研究ではX線結晶構造解析によりCagA-SHP2複合体の立体構造を解析することで、CagAによるSHP2活性化の分子基盤を解明することを目的としている。
本年度は研究実施計画としてEPIYA-Dペプチド-SHP2複合体およびEPIYA-D-CMペプチド-SHP2-PAR1複合体の結晶化条件の探索とクライオ電子顕微鏡による立体構造解析を行うこととしていた。昨年度までに、複合体の安定性が高くなる傾向のあった条件下でEPIYA-D-CMペプチド-SHP2-PAR1複合体を形成させた後、結晶化ロボットを使用して広範囲の結晶化条件を検討したが、結晶の得られる条件はなかった。今後も引き続き複合体の安定性解析と結晶化スクリーニングを実施していく。結晶化スクリーニングと同時に、EPIYA-D-CMペプチド-SHP2-PAR1複合体のクライオ電子顕微鏡を用いた立体構造解析を目指し、サンプルの調製を開始した。今後はEPIYA-D-CMペプチド-SHP2-PAR1複合体の負染色法を用いた電子顕微鏡像を確認することで、クライオ電子顕微鏡での立体構造解析に適したサンプルの取得を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
今年度も新型コロナウイルスの感染拡大の影響から在宅勤務期間が長くなったことなどにより、当初の計画からかなり遅れが出ている。現時点では結晶化条件のスクリーニングとクライオ電子顕微鏡での観察に向けてサンプルの調製を行っている段階である。今後も引き続き結晶化条件の探索と、クライオ電子顕微鏡で観察するのに適したサンプルであるかを確かめるために負染色法を用いて電子顕微鏡観察を行う計画である。その際にはこれまでに行なってきた複合体の安定性解析が有用であると考えている。以上のように当初の計画からは遅れがあるが、次年度は新たな手法を加えることで研究が進捗することと期待している。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、これまで通り結晶化条件の探索を行なっていくが、クライオ電子顕微鏡による立体構造解析を優先して行う。まず、これまでに用いてきたEPIYA-D-CMペプチド-SHP2-PAR1複合体を負染色法で染色して電子顕微鏡観察し、よりコントラストの強い画像を取得することで、クライオ電子顕微鏡で観察するために十分なサンプルであるかを確認する。その際に、複合体が形成されている割合を基準として複合体安定性の確認が可能であると考えている。そこで良いサンプルであることが確認されたら、次に、クライオ電子顕微鏡で観察するためのグリッドの作製条件の検討を開始する。解析可能な画像が取得できた場合は二次元クラス分けを行う。二次元クラス分けが順調に進行した場合には立体構造の再構築を行う。
結晶構造解析あるいはクライオ電子顕微鏡による立体構造解析により立体構造情報が得られた場合、当初の計画通り、CagA-SHP2複合体形成ならびにCagA-SHP2-PAR1複合体形成を阻害するCagA変異体分子の作製および立体構造解析により得られたCagA変異体分子の生物学的機能の解析を開始する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は新型コロナウイルス感染流行の影響により急遽施設の利用ができなくなるなど、実験実施状況に遅れが生じている。研究計画では結晶化スクリーニングに加えてクライオ電子顕微鏡による立体構造解析を開始する予定であったが、現状として結晶化条件のスクリーニングとサンプル調製を行っている段階である。従って、研究の遅れに伴い本年度使用額が次年度に持ち越された。以上の事由から次年度使用額が発生した。しかし、次年度はクライオ電子顕微鏡による立体構造解析を開始する予定であるため、クライオ電子顕微鏡のマシンタイム使用料等に、本年度までに使用予定であった残額を充てていく。さらに、実験の進行に伴い、本年度に使用する予定であった試薬や解析用PCも順次購入する。
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