| 研究課題/領域番号 |
18K15185
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
植畑 拓也 京都大学, 医学研究科, 助教 (50785970)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | RNA分解 / lineage bias / single cell RNA seq |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では、RNA endonucleaseであるRegnase-1(Reg1)とそのファミリー遺伝子であるRegnase-3(Reg3)に着目し、骨髄におけるリンパ球分化がどのようにmRNA安定性制御を介した転写後調節によって決定されているのかを明らかにするものである。これまでのところ、造血幹細胞からリンパ球系あるいはミエロイド系前駆細胞への分化系譜に関する詳細な分子機構は明らかにされていない。
平成３１年度は、これまでの表現型解析から得られた結果に基づき、Reg1とReg3を介した分子機構について焦点を絞り解析を進めた。Reg1/Reg3二重欠損細胞で観察されるリンパ球系前駆細胞の分化障害には、myeloidまたはmegakaryocyte-erythroidに特徴的な遺伝子が異所性に発現することをbulk-RNA seqによって明らかにしたが、その背景にあるメカニズムに関して検討が不十分であった。これに対して、HSPC分画を用いてsingle cell RNA seqを行った。結果、マウス表現型に一致して、野生型と比較しReg1/Reg3二重欠損細胞は、リンパ球系分化に認められる遺伝子発現が低下し、逆にミエロイド系細胞分化に関連した遺伝子発現の上昇が認められた。さらに解析を進めた結果、最終的にReg1/Reg3の標的遺伝子として遺伝子Xを同定した。野生型マウス由来リンパ球系前駆細胞株を用いて遺伝子Xを過剰発現すると、B細胞分化が著しく障害されると同時に、ミエロイド系細胞分化が誘導されることがわかった。
このような研究結果により、Reg1とReg3が炎症環境においてどのように血球分化の運命を制御するのかに関して、分子機構の一端を見出しつつある。この研究成果を踏まえ現在、炎症とミエロイド分化についてさらに詳細な分子機構の解明を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和元年度の研究成果から、骨髄造血幹細胞においてReg1とReg3が制御する遺伝子Xがミエロイド系細胞分化への運命決定において重要であるという結果を得た。これは平成３０年度から取り組んできたsingle cell RNA seqによるデータ解析の成果が大きく貢献している。また、この解析結果はin vitroのリンパ球分化培養系においても、これを支持する結果を得ている。このin vitro培養系に関しては、前年度よりマウス骨髄細胞から樹立し、ようやく研究成果が得られつつあり、遺伝子Xの同定のタイミングと相まって、Reg1/Reg3による血球分化制御における分子機構の一端が解明されることが期待される。同時に、in vivoにおける解析においてもデータが蓄積されてきている。in vivo解析に用いたマウスは、コンベンショナルな遺伝子欠損の他、様々な分化段階に特異的に発現するcre-loxPシステムを用いており、骨髄におけるReg1/Reg3の細胞特異的な機能の解明が期待される。
一方で、骨髄前駆細胞株を用いたReg1とReg3の標的遺伝子の網羅的解析には、Reg1/Reg3の発現量の低さなどの問題や、Reg3遺伝子座にタグをノックインした内因性タンパク質での検出効率などいくつかの問題点が判明したため、予定していたCLIP-seq法は困難であることが判断した。このため、強制発現系やRIP法といった、より現実性の高い方法への変更を予定している。実際にRIP-qPCR法では良好な結果を得ており、さらに慎重に解析を進めているところである。
以上のことから、令和元年度の進捗状況としては概ね順調に進展しており、これに基づき、令和２年度に行うべき実験計画にむけて整備・実行されつつある状況である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は、初年度からの研究内容を取りまとめ論文化を目指す。したがって、今年度中の具体的な研究内容は、これに必要不可欠な実験を中心に推し進めていくことになる。特に、Reg1/Reg3の標的遺伝子Xに関するメカニズムに関して、ミエロイド系細胞分化への偏向に直接の原因となっているかどうか、in vitro及びin vivo両面から明らかにしたいと考えている。具体的には、今回樹立したマウス骨髄由来リンパ球系前駆細胞を用いて、遺伝子Xに対してノックダウンを行い、リンパ系・ミエロイド系分化にどのように影響を与えるかを検討する。またこれに関して、in vivoにおいてもReg1/Reg3が制御する遺伝子Xの機能的役割について検討を進める。これに必要なマテリアルや遺伝子改変マウスはすでに入手しており、準備が整った段階で順次研究を開始することが可能である。また、前年度において予定していた研究内容のうち結果が得られていないものに関して、継続的に研究を進める。但し、予定していた骨髄リンパ球系前駆細胞株を用いたCLIP-seqに関しては、前項に述べたように幾つかの問題点が判明したため、強制発現系を用いた手法などに変更し、より実現可能性の高い方法を検討する。今年度は最終年度として、これらの研究結果を統合し論文化に向けてデータの取りまとめ作業を行い、論文投稿を予定している。
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