| 研究課題/領域番号 |
18K15213
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
幾尾 真理子 広島大学, 医歯薬保健学研究科(薬), 助教 (60713401)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 多発性骨髄腫 / エクソソーム / 細胞外小胞 / 骨分化 / BMP / 骨芽前駆細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、多発性骨髄腫細胞による骨芽前駆細胞分化阻害分子機構におけるエクソソームの関与及びその分子機構を明らかにすることである。
本年度は、以前までに新規同定した多発性骨髄腫細胞による骨芽前駆細胞分化阻害活性について詳細な解析の追加を行った。これらの結果については現在は論文投稿段階にある（Journal of Extracellular Vesicles, in revise）。内容を以下に示す。エクソソームは他の細胞外小胞との分離が技術上困難であるため、キットを用いた方法ではなく超遠心法を用いた調製法が推奨されている。超遠心法を用いて回収したエクソソームサンプルを用いて以前までに検討した点について解析したところ、超遠心法回収サンプルはキット調製サンプルと同様の活性を示した。また複数の多発性骨髄腫株由来エクソソームが骨分化シグナル経路の各段階に対して同様の活性を示すことも確認した。マウス骨芽前駆細胞MC3T3-E1・骨分化因子Bone Morphogenic protein 2（BMP2）添加系は従来から良く用いられる骨分化モデルであり本研究でも従来これを用いて来た。ヒト細胞に対しても多発性骨髄腫細胞由来エクソソームが骨分化抑制効果を示すか明らかにするため、BMP2を添加したヒト骨肉腫細胞株において同様の解析を行ったところ、多発性骨髄腫細胞由来エクソソームはマウス細胞・ヒト細胞において同様の効果を示すことがわかった。以上の結果は、骨芽前駆細胞分化阻害活性をもつエクソソームは細胞株によらず多発性骨髄腫株から分泌されており、またその標的となる分子機構もマウス細胞・ヒト細胞間で保存されていることを示唆する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本研究について論文投稿準備が進んでおり、また初年度に予定していた研究項目についても順調に推移しているため。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）多発性骨髄腫由来エクソソームが核内のSmadを阻害する分子機構を明らかにする
既知核内Smad活性制御因子について、ChIPデータベースや論文で報告のある因子について、Western blot法や細胞免疫染色法を用いて細胞全体・核内における発現や活性化状態がエクソソーム処理時に変化するか検討する。
２）核内のSmadの機能を多発性骨髄腫由来エクソソームが阻害する分子機構を明らかにする-2
既知因子で説明できない場合は未知制御因子を同定するため、Smad複合体構成因子や（共免疫沈降法）、標的DNA結合因子を同定し（Rapid immunoprecipitation mass spectrometry (RIME)法: ChIP実験条件で沈降したDNAに対する結合タンパク質の同定法、標識DNAを用いたプルダウン）、エクソソーム作用時に生じる変化を検出する。所属研究室で他分子について確立したRIME実験系を本研究に応用する。上で同定した因子を骨芽前駆細胞に導入・ノックダウン等するとエクソソーム様の活性を示すか、またはエクソソームの活性が抑制されるか検討する。
３）エクソソームの骨分化抑制活性における責任因子は何か
Smad阻害因子がエクソソーム内に存在するか、Western blot法等を用いて検討する。存在しない場合は阻害因子の制御因子について順次同様に検討する。当該因子の必要性について検討するため、多発性骨髄腫において遺伝子のノックダウン等を行いエクソソームから当該因子を除去した時の骨分化抑制活性の有無について検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初購入を予定していた抗体や学会参加費・旅費等が不要であったり、無料サンプルや既に入手している材料で賄うことができたため。
使用計画：基本的に当初の研究計画にそってすすめる。当該経路に関わる因子の探索時に検討対象の分子や検討条件などを増やし、そのために必要な抗体などの試薬類を次年度使用額を活用して購入する。
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