| 研究課題/領域番号 |
18K15231
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| 研究機関 | 愛知県がんセンター(研究所) |
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研究代表者 |
奥田 真帆 愛知県がんセンター(研究所), 分子腫瘍学分野, リサーチレジデント (50803441)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 悪性中皮腫 / CRISPR/Cas9スクリーニング / 上皮間葉転換 / 足場非依存増殖能 / 不死化正常中皮細胞 / がん化 |
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| 研究実績の概要 |
悪性中皮腫はアスベスト曝露によって発症する中皮細胞由来の腫瘍で、3種類の主要な組織型が存在する (上皮型、肉腫型、二相型)。最も悪性度の高い肉腫型の形成には、上皮間葉転換関連の遺伝子が大きく関与していることが示唆されている。本研究では、ゲノム編集技術を用いた網羅的遺伝子ノックアウトスクリーニングによって、中皮細胞のがん化・悪性化や、または上皮間葉転換に関わる新規遺伝子の探索を行い、中皮細胞がん化に必要な因子、悪性中皮腫の組織型を規定する分子を解明することを目的とする。
1. CRISPR/Cas9による網羅的遺伝子ノックアウト細胞群の作製
本研究に使用する不死化正常中皮細胞株を用いて、Cas9安定発現株を樹立した。さらにプール化されたヒトゲノムワイドsgRNAライブラリー (レンチウイルス) を調製し、前述のCas9発現細胞株に導入し、遺伝子ノックアウト細胞群を作製した。
2.上皮間葉転換を起こした細胞のスクリーニング
上皮間葉転換により間葉系形質を獲得した細胞は運動能が亢進することに着目し、遺伝子ノックアウト細胞群から、運動能を獲得した細胞をボイデンチャンバーアッセイ法によって分離することを試みた。細胞数や培養時間等の条件検討に加え、メンブレン抗体アレイキットを用いて不死化正常中皮細胞内で活性化している受容体を解析し、ボイデンチャンバー下層に添加する増殖因子を検証した。続いて、細胞極性を制御するRac1の活性型変異体を発現させた運動能獲得モデル細胞を作製し、コントロール細胞と共にボイデンチャンバーアッセイを行った。その結果から運動能を獲得した細胞のセレクションに対して、ボイデンチャンバーアッセイ法は有効と判断し、スクリーニングを行なっている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は上皮間葉転換に関連する遺伝子の探索に重点をおいて研究を進めた。まず、不死化正常中皮細胞株を用いてCRISPR/Cas9による網羅的遺伝子ノックアウト細胞群を作製した。この細胞群から上皮間葉転換を起こして間葉型に分化した細胞をスクリーニングするため、ボイデンチャンバーアッセイ法を用いて、細胞をその運動能で分離する方法について検討した。現在はスクリーニングを実施しており、おおね計画通りに進行していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. 上皮間葉転換に関連する遺伝子の探索
現在実施しているスクリーニングで得られる細胞からDNAを精製し、NGS解析を用いて挿入されているsgRNAの配列解析を行い、運動能の獲得に関与している候補遺伝子を同定する。これらの候補遺伝子についてノックダウンなどにより機能解析を行い、上皮間葉転換の誘導能を検討する。
2. 発がん関連遺伝子の探索
網羅的遺伝子ノックアウト細胞群から、足場非依存的増殖能を獲得した細胞をスクリーニングする方法の検討を行い、スクリーニングを実施する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
申請者が所属研究機関を異動することになり、納品が次年度になる恐れのある物品の購入および解析の外注について発注を控えたため、未使用額が生じた。未使用金額は次年度に元々予定していた用途のために使用する。
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