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2019 年度 実施状況報告書

悪性中皮腫の発生・悪性化・中皮細胞の上皮間葉転換にかかわる新規遺伝子の同定

研究課題

研究課題/領域番号 18K15231
研究機関順天堂大学

研究代表者

奥田 真帆  順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 博士研究員 (50803441)

研究期間 (年度) 2018-04-01 – 2021-03-31
キーワード悪性中皮腫 / CRISPR/Cas9スクリーニング / アノイキス / 足場非依存的増殖能
研究実績の概要

悪性中皮腫はアスベスト曝露によって発症する中皮細胞由来の腫瘍で、3種類の主要な組織型が存在する (上皮型、肉腫型、二相型)。最も悪性度の高い肉腫型の形成には、上皮間葉転換関連の遺伝子が大きく関与していることが示唆されている。本研究では、ゲノム編集技術CRISPR/Cas9を用いた網羅的遺伝子ノックアウトスクリーニングによって、中皮細胞のがん化・悪性化や、または上皮間葉転換に関わる新規遺伝子の探索を行い、中皮細胞がん化に必要な因子や悪性中皮腫の組織型を規定する分子を解明することを目的とする。
昨年度作製した、不死化正常中皮細胞株 (HOMC株) のCas9安定発現株に対して、プール化されたヒトゲノムワイドsgRNA ライブラリーを搭載したレンチウイルスを感染させ、網羅的遺伝子ノックアウト細胞群を作製した。
足場非依存的増殖能の獲得は、細胞ががん化に伴い獲得するがん形質の一つである。HOMC株を浮遊培養すると、ほとんどの細胞が死滅する。これに対してHOMC株に転写因子YAPの活性型変異体を発現させた「がん化モデル細胞」は浮遊条件で増殖が可能となった。足場非依存的増殖能の獲得に関与する遺伝子をさらに探索するために、上記の遺伝子ノックアウト細胞群について浮遊培養アッセイを行い、生存細胞をスクリーニングした。現在はこれらの細胞からゲノムDNAを精製し、挿入されているsgRNA配列を解析している。今後は同定した候補遺伝子の機能や悪性中皮腫発症との関連を解析していく予定である。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究では、正常不死化中皮細胞 (HOMC株) を用いて作製した網羅的遺伝子ノックアウト細胞群に対して2種類のスクリーニングを行い、がん形質の獲得に関与する遺伝子の同定および機能解析を行う。
(1) 上皮間葉転換を起こした細胞のスクリーニング
上皮間葉転換を起こして高い細胞遊走を獲得した細胞を、ボイデンチャンバーを用いた細胞遊走アッセイにより分離する。本スクリーニングは昨年度より継続して行なった。
(2) 足場非依存的増殖能を獲得した細胞のスクリーニング
このスクリーニングでは細胞を浮遊培養し、生存・増殖を続けた細胞を選別する。本年度は浮遊培養スクリーニングを実施し、回収した細胞のゲノムDNAに挿入されているsgRNA配列の解析をほぼ完了しており、概ね計画通りに進行していると言える。

今後の研究の推進方策

スクリーニングで得られた細胞のゲノム解析を通して、上皮間葉転換または足場非依存的増殖能の獲得に関与する候補遺伝子を同定する。これらの候補遺伝子についてその機能やシグナル伝達への関与を解析し、標的のがん形質の獲得、さらには不死化正常中皮細胞のがん化を起こす分子機序を検討する。

次年度使用額が生じた理由

本年度に実施した浮遊培養スクリーニングでは、当初は超低接着表面6ウェル培養プレートの使用を予定していたが、底面積あたりの価格がより安価な超低接着表面チャンバーに変更したため、差額の約15万円が残った。この未使用額については次年度の細胞培養器具の購入に使用する。また、遺伝子の機能解析のためのプライマーやプラスミドの一部、および使用期限の短いキット等の購入を次年度に先送りしたため、未使用額が生じた。これらについては、次年度に予定していた用途のために使用する。

  • 研究成果

    (2件)

すべて 2019

すべて 雑誌論文 (1件) 学会発表 (1件)

  • [雑誌論文] MPNのゲノム解析研究の進歩2019

    • 著者名/発表者名
      奥田 真帆、荒木 真理人、小松 則夫
    • 雑誌名

      血液内科

      巻: vol. 79 ページ: 556-564

  • [学会発表] 真正トリプルネガティブ本態性血小板血症における臨床的・分子生物学的特異性2019

    • 著者名/発表者名
      稲野 資明、荒木 真理人、森下 総司、落合 友則、三澤 恭平、福田 泰隆、緑川 直子、ぬで島 麻衣、伊藤 雅文、大佐賀 智、枝廣 陽子、今井 美沙、田口 鉄平、奥田 真帆、大坂 顯通、小松 則夫
    • 学会等名
      第81回日本血液学会学術集会

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公開日: 2021-01-27  

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