2018 年度実施状況報告書

テーラーメイドのがん免疫治療に向けた新しい細胞傷害性T細胞測定法の確立

研究課題

研究課題/領域番号	18K15430
研究機関	埼玉医科大学
研究代表者	高木徹埼玉医科大学, 医学部, 助手 (20536891)
研究期間 (年度)	2018-04-01 – 2022-03-31
キーワード	CTL / 細胞傷害性試験
研究実績の概要	本研究の目的は、ヒト固形がんのほぼすべてに発現しているがん抗原WT1 に着目し、WT1特異的CTLを用いた細胞傷害性試験を行い、同時に免疫チェックポイント分子の発現を確認し、そのデータがテーラーメイド医療に繋げることができるかどうかを明らかにすることである。今年度の実績として、ヒト固形がんのほぼすべてに発現するWT-1を発現する組換えアデノウイルスの作製を行なった。 WT1遺伝子を作製し専用のベクターに挿入し、AD-293細胞にウイルス液と遺伝子導入ベクターを入れることにより、相同組換えを起こさせ、組換えアデノウイルスを作製した。作製したウイルスをAD-293細胞に感染させ増殖させた。増殖したウイルスを希釈しAD-293細胞に感染させ、CPEを観察しウイルス価の測定を行なった。また、ウイルス感染細胞にWT-1が発現しているかどうかをウエスタンブロットで確認した。現在この組み換えアデノウイルスをマウスに感染させ、リンパ球を取り出した後に試験管内で抗原刺激をし、細胞傷害活性の測定を行なっている。細胞傷害性試験と同時に、標的細胞のアポトーシスを確認するために、標的細胞をAnnexin-V、もしくはCaspase-3で染色し測定を行なった。しかしAnnexin-Vではアポトーシスが測定できたが、Caspase-3の染色過程で標的細胞の膜を透過処理する必要があり、標的細胞に発現しているGFPの強度が低下してしまい、細胞傷害活性の測定が不十分になってしまうのが現状である。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由まず初めに、組み換えアデノウイルスを作製する過程で、できた組み換えウイルスを細胞に感染させても、WT-1タンパクが発現しなかったことが挙げられる。その原因として、うまく相同組み換えが起こらず、WT-1遺伝子が組み換えウイルスに挿入していなかったことが挙げられる。実験手法を改良し、できた組み換えウイルスでは、細胞に感染させるとWT-1タンパクが発現していた。この組み換えウイルスの作製に時間がかかったのが遅れの原因である。続いて、細胞傷害性試験と同時に、標的細胞のアポトーシスを確認するために、標的細胞をAnnexin-V、もしくはCaspase-3で染色を行なった。しかしながら、Caspase-3の染色過程で標的細胞の膜を透過処理する必要があり、標的細胞に発現しているGFPの強度が低下してしまい、細胞傷害活性の測定が不十分になってしまうのが現状である。この問題を解決するために、現在、実験の手法を変えてアポトーシスの測定を行なっている。
今後の研究の推進方策	細胞傷害性試験と同時に、CTLの免疫チェックポイント分子 (PD-1, CTLA-4, Tim-3, LAG-3, B7-H3, DC-HIL)の測定を行う。これはCTLとGFP発現標的細胞を混合すると同時に、ラベル抗体を入れ4時間インキュベーション後に測定する。そして、どの組み合わせで行うのが最適か比較検討する。実験が問題なく進むなら、免疫チェックポイント分子だけでなく、CD107aやMHC-tetramerでの染色を同時に行う。次に作製した組み換えアデノウイルスをマウスに感染させ、リンパ球を取り出した後に試験管内で抗原刺激をし、細胞傷害活性の測定を行ない、細胞傷害活性が測定できるか確認を行う。傷害活性が確認できたら、これまでと同様にアポトーシスや免疫チェックポイント分子の測定、CD107aやMHC-tetramerの測定をまずHLA-A2を発現する標的細胞で確認する。HLA-A2分子で測定できることが確認後、HLA-A24を発現する細胞、もしくはトランスジェニックマウスを用いて実験を行う。
次年度使用額が生じた理由	主に使用している抗体やウエスタンブロット試薬、細胞培養のフラスコやディッシュ類を購入するには、現在の残金では足りないので、繰り越して次年度に使用することを考えた。