| 研究課題/領域番号 |
18K15444
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
中野 博人 金沢大学, 附属病院, 医員 (10804263)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 高速原子間力顕微鏡 / amyloid β / 凝集 |
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| 研究実績の概要 |
平成30年度は、合成Aβ1-40、Aβ1-42ペプチド、E22Q Aβ1-40及びE22Q Aβ1-42ペプチドを購入し、0.02 % アンモニア溶液と20 mM phosphate bufferを用いて、Aβ1-40、Aβ1-42、E22Q Aβ1-40及びE22Q Aβ1-42のそれぞれのmonomer溶液（25 μM）を作成した。一部を-80℃で凍結保存し、残りをマイクロチューブ内に500μlずつ分注し、37℃のシェイキングインキュベーター内で凝集させ、Aβ1-40、Aβ1-42、E22Q Aβ1-40及びE22Q Aβ1-42凝集体を作成した。作成したAβ凝集体を氷上で超音波発生器により破砕し、Aβ1-40、Aβ1-42、E22Q Aβ1-40及びE22Q Aβ1-42 seedsを作成した。そのseedsを以下のような組み合わせでAβ monomer溶液に加え、観察されるAβの凝集過程をチオフラビンT (Thioflavin T; ThT) を用いて継時的にモニタリングし、比較検討した。
・Aβ1-40 monomer溶液＋Aβ1-40 seeds or Aβ1-42 seeds or E22Q Aβ1-40 seeds or E22Q Aβ1-42 seeds
・Aβ1-42 monomer溶液＋Aβ1-40 seeds or Aβ1-42 seeds or E22Q Aβ1-40 seeds or E22Q Aβ1-42 seeds
・E22Q Aβ1-40 monomer溶液＋Aβ1-40 seeds or Aβ1-42 seeds or E22Q Aβ1-40 seeds or E22Q Aβ1-42 seeds
・E22Q Aβ1-42 monomer溶液＋Aβ1-40 seeds or Aβ1-42 seeds or E22Q Aβ1-40 seeds or E22Q Aβ1-42 seeds
上記in vitro実験系と並行し、世界最速の高速原子間力顕微鏡 (high-speed atomic force microscopy; HS-AFM) を用いたAβの凝集過程や構造のイメージングを実施した。合成Aβ1-42の観察に関しては、本研究の研究協力者らの既報告 (Watanabe-Nakayama T, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2016) に準じて実施し、既報告と同様に合成Aβ1-42の凝集過程及び構造を単一線維レベルで観察することに成功した。また合成Aβ1-40、E22Q Aβ1-40及びE22Q Aβ1-42 monomerのイメージングは、各サンプルの濃度や塩濃度を調整し、観察可能条件を検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
HS-AFMによる合成Aβ1-42の凝集過程及び構造のイメージングに関しては、既報告と同様に観察することができた。また、合成Aβ1-40の観察においては、当初マイカにAβ1-40 seedsが安定して付着しなかったが、サンプル調整の行程を見直し改良することで、Aβ1-42 seedsと同様に観察視野内に複数のAβ1-40 seedsをイメージングすることに成功した。現状では、Aβ1-40の凝集速度が遅いため、HS-AFMのイメージングでAβ1-40の凝集過程を観察できないことが明らかになったため、Aβ濃度や塩濃度を調整するほか、本研究の研究協力者である中山 隆宏先生（金沢大学新学術創成研究機構 ナノ生命科学研究所 理工研究域バイオAFM先端研究センター 准教授）の協力の基、血管内皮の基底膜の構成成分であるラミニンやコラーゲンIV型を含む人工基底膜マトリックス成分をマイカ上に貼り、その上でAβ1-40の凝集過程をイメージングする方法を検討している。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成31年度は、平成30年度同様、合成Aβ1-40、Aβ1-42、E22Q Aβ1-40及びE22Q Aβ1-42を用いた試験管内での凝集実験を継続する。
HS-AFMによるAβ凝集のイメ―ジングにおいては、マイカ上にコラーゲン線維成分を貼り、その上での合成Aβ1-40の凝集過程をイメージングできる観察条件を見出し、生体内におけるAβ1-40の凝集過程や形態を観察する実験モデルを確立する。
さらに、E22Q Aβ1-40及びE22Q Aβ1-42においても同様にHS-AFM観察下でイメージングが可能となる条件を見出し、Dutch APP mutationを有する遺伝性Alzheimer病の病理学的所見として認められる脳血管へのAβ沈着に関連するAβの凝集過程や形態学的特徴を観察する実験モデルの確立を進める。
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