| 研究課題/領域番号 |
18K15466
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
横田 睦美 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10647415)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | iPS細胞 / ドーパミン神経細胞 / CLEM / ミトコンドリア |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではiPS細胞由来ドーパミン神経細胞をGFP標識することによりドーパミン神経特異的なミトコンドリア機能・形態解析を可能にし、パーキンソン病におけるドーパミン神経特異的な変性機序を見出すことを主目的としている。
昨年度はCRISPR/Cas9システムによりドーパミン神経に特徴的なマーカーTyrosine Hydroxylase（TH）遺伝子にGFP遺伝子をノックインしたTH-GFP iPS細胞を健常者及びPARK2患者において作製した。今年度は樹立した健常者及びPARK2 TH-GFP iPS細胞を用いて光顕電顕相関観察法（CLEM）を行った。健常者及びPARK2 TH-GFP iPS細胞から分化誘導を行った神経細胞をグリッド付きのカバーガラスに播種した。その後の光学顕微鏡による撮像でGFP陽性神経細胞、GFP陰性神経細胞の位置情報を得た後、そのまま包埋・薄切し、電子顕微鏡観察を行った。その結果、GFP陽性であるドーパミン神経細胞はGFP陰性であるその他サブタイプ神経細胞と比較してミトコンドリアのサイズが有意に小さいことが明らかになった。この傾向は健常者、患者どちらにおいても同様の傾向であった。
さらに、健常者及びPARK2 TH-GFP iPS細胞を用いてミトコンドリア膜電位の評価を行ったところ、GFP陽性ドーパミン神経細胞はその他サブタイプ神経細胞と比較してミトコンドリア機能も低い状態であることも示された。
これらの解析結果から、iPS細胞由来ドーパミン神経細胞において細胞種特異的にミトコンドリアが小さく低機能であることが明らかになり、このことがドーパミン神経細胞の脆弱性の要因の一つとなっている可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ドーパミン神経細胞に特化したミトコンドリアの超微形態学的解析はこれまでになされておらず、今年度の研究によりレポーターiPS細胞のCLEMへの応用、標識した細胞におけるオルガネラの詳細な形態解析が可能であることが示された。
今年度の研究においては当初の計画通り、ドーパミン神経特異的なミトコンドリアの形態的特徴がCLEM解析により明らかになった。さらにレポーターiPS細胞を用いたライブセルイメージングにより、ミトコンドリアの機能についても他のサブタイプの神経細胞より低いことが見出された。これらの結果はパーキンソン病患者で認められるドーパミン神経特異的な細胞死の要因の一つとなっている可能性があり、今回の研究結果は重要な進展であったといえる。
また、今回見出された神経のサブタイプによるミトコンドリアのサイズや機能の違いについての知見は、多様な神経細胞におけるミトコンドリアの役割の基礎的な理解へとつながり、本研究結果は重要な成果である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、健常者及びPARK2患者TH-GFP iPS細胞由来神経細胞においてミトコンドリアストレスであるCCCP処理を行った上でCLEM解析を行う。健常者と患者間でのドーパミン神経特異的なミトコンドリアの超微形態学的変化についての違い、細胞死との関連について明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
昨年度に子の出産による産前産後・育児休暇の取得により実験を約11ヶ月間停止したため昨年度の未使用額が大部分残っている。
次年度もTH-GFP iPS細胞由来ドーパミン神経細胞の機能・形態解析を引き続き行うため、培養関連試薬やミトコンドリアの機能・解析用試薬のために研究費の大部分を使用する。また、これまでの研究成果を発表するための学会経費や論文投稿費にも使用する。
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