研究課題
申請者は前年度までに、磁気細胞分離法を用いて海馬からアストロサイトを分離しRNAを抽出する系を確立し、側頭葉てんかんモデルマウスのアストロサイトからmRNAを抽出し、次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析を行うことで、てんかん原生型アストロサイトの分子プロファイルを網羅的に解析した。また、解析結果からアストロサイト性のてんかん関連候補分子を200遺伝子前後リストアップした。このうち、薬理学・分子生物学的操作が可能である候補遺伝子10遺伝子前後について、qRT-PCR法を用いて発現変動の有無について再現性を確認した。その中で、候補遺伝子の分子産物についてそれらの薬理学的操作が、アストロサイトのCa2+興奮性及び神経活動に与える影響を、海馬急性スライス標本（ex vivo）を用いて解析した。その結果、ある受容体（X受容体とする）の発現亢進がてんかん原生型アストロサイトの本質的な機能変調の原因の一つとなっている可能性を見出した。（てんかん性アストロサイトではCa2+興奮性が亢進していたが、これがX受容体の阻害剤で軽減した。）本年度は、上記X受容体のアストロサイト特異的・時期特異的ノックアウトマウスを作成し、基本的な属性の評価を行った。その結果確かに時期特異的アストロサイト特異的にX受容体がノックアウトできることを、蛍光免疫染色法を用いて確認した。また、このマウスにおいててんかん原生獲得が予防されうる可能性があることを、行動実験を用いて確認した。
2: おおむね順調に進展している
当初の計画に概ね沿って進行した。研究期間を延長しているが、本研究の目的をよる精緻に達成するために、時期特異的細胞種特異的X受容体ノックあるとマウスを作成し、追加の解析を行うことができた。当初の計画を延長はしているが、上記のような理由のため、本来の目的よりも進展していると考えている。
本研究では、てんかん病態時の活性化アストロサイトの異常活動と神経細胞の過剰同期興奮（てんかん発作）との因果関係を分子レベルで明らかにすることを最大の目的としている。つまり、「てんかん原生の分子病態を活性化アストロサイトの視点から明らかにする」ものである。次年度は、当初の計画を延長して、トランスクリプトーム解析により得られた発現変動遺伝子産物（X受容体）をもとにして作成した、アストロサイト特異的X受容体ノックアウトマウス用いて、追加の解析（てんかん原生獲得との関連を、行動実験、免疫組織染色、Ca2+ imaging）を行う予定としている。これにより、in vivoおよびex vivoでの機能解析を追加検討することで、アストロサイトを標的とした新規抗てんかん薬の候補を探索していく。
新型コロナウイルス感染症対応などで、エフォートが下がったこと、実験の物品の納期にずれが出たことにより当初計画に若干の遅れがでた。一方で、当初計画よりも研究が進展する見込みもあったため、必要予算を繰り越すことにしたため。繰り越した予算は、追加実験に使用する予定である。
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JCI insight
巻: 6 ページ: e135391
10.1172/jci.insight.135391.
https://yuhp-ped.jp/
https://www.med.yamanashi.ac.jp/clinical_basic/pharmaco/1-Japanese/home.html
