研究課題
骨形成不全症(OI)は主にⅠ型コラーゲンの異常により骨脆弱性を呈する先天性骨系統疾患である。本疾患に対してビスホスホネート製剤による姑息的治療が行われているが重症例においては治療効果が乏しい。通常骨は破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成からなる骨カップリングが正常に起こることで骨強度が維持されている。また破骨細胞と骨芽細胞の間には双方向性の骨カップリング機構があり、これにより骨リモデリングが調整されている。本研究では骨カップリング異常を標的としたOIに対する新規治療の開発を目的とする。まずOIにおける骨カップリング異常を明らかにするため、OIモデルマウス由来破骨細胞と、骨芽細胞の初代培養を行う。次に骨リモデリング異常を規定するカップリング因子を確認し、その機序に作用する薬剤を探求する。そのため本研究ではOIモデルマウスを使用する必要がある。様々なモデルマウスが報告されており、利用可能となっているが、その中でCol1a2oimマウスはOIの病態として骨病変をきたすことが報告されているため本研究ではこのマウスを使用することとしている。これまでに本マウスをオリエンタル酵母工業株式会社を介して米国のThe Jackson Laboratoryから購入し、申請者の試用する動物施設に導入した。その後体外受精を通じてSPF化に成功し、同動物実験施設でmatingを行っている。また同マウスのgenotypingについては既報の論文よりプライマー設計を行いWTマウスと変異を有するマウス(heterozygousとhomozygous)がともに検出できることを確認した。現在実験に必要となるマウスを確保するため順次matingを行っており、遺伝子変異を有するマウスが作出されていることを確認した。
2: おおむね順調に進展している
本研究を遂行するためにはOIモデルマウスが必要である。Ⅰ型コラーゲンのα2鎖をコードするCOL1a2遺伝子に変異を有するCol1a2oimマウスはhomozygousに変異を有するとき骨脆弱性を主とする骨病変を有することが報告されている。そこでCol1a2oimマウスを本研究に使用することを計画し申請した。本研究計画が受理されたのち本マウスをオリエンタル酵母工業株式会社を介して米国のThe Jackson Laboratoryから購入し、申請者の試用する動物施設に導入した。その後体外受精を通じてSPF化に成功し、同動物実験施設でmatingを行っている。また同マウスのgenotypingについては既報の論文よりプライマー設計を行いWTマウスと変異を有するマウス(heterozygousとhomozygous)がともに検出できることを確認した。現在実験に必要となるマウスを確保するため順次matingを行っており、遺伝子変異を有するマウスが作出されていることを確認した。今後本マウスを使用して実験を遂行していく初期段階は順調に進展していると判断したため上記区分を(2)おおむね順調に進展しているとした。
現在繁殖飼育中のCol1a2oimマウスが実験に必要な数得られれば、当初の計画通りCol1a2oimマウスの骨病変の表現型を野生型マウスと比較検討する。Col1a2oimマウスと野生型マウスを用いた破骨細胞、骨芽細胞の初代培養を確立する。これらの初代培養破骨細胞と初代培養骨芽細胞におけるカップリング因子の発現を検討する。次にこれら破骨細胞と骨芽細胞の共培養を行う。この時Col1a2oimマウスと野生型マウスの破骨細胞と骨芽細胞を組み合わせることで4種類の共培養を行う。そして骨芽細胞マーカー(Runx2, Osterix, Alp, Col1)、破骨細胞マーカー(NFATc1、cFos、Cathepsin K、TRAP)の発現を確認するとともに破骨細胞形成能もTRAP染色を行い確認する。これらの実験でOIの病因と考えられるカップリング機構異常を同定したら次にその機構に特異的に作用する薬剤を用いて同様に共培養の実験で治療効果を評価する。最終的にはこれらの実験で同定された薬剤をCol1a2oimマウスに投与し、骨の脆弱性や骨代謝マーカーに対する治療効果を判定する。この時骨病変に及ぼす効果のみならず、歯牙形成不全に対する治療効果も判定する。
当該年度に開始したOIモデルマウスの導入および繁殖は次年度以降も継続して行う必要があるため次年度使用分を合わせ使用してく。また次年度は分子生物学的実験を開始していくためそちらに対しても使用していく予定である。
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