| 研究課題/領域番号 |
18K15873
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立循環器病研究センター |
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研究代表者 |
伊藤 慎 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 病院, 室長 (20796560)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 心肥大 / 遺伝子解析 |
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| 研究実績の概要 |
1. Mtus1バリアントの発現制御解析 c-mycの強制発現によりMtus1Aの発現増加がみられたため、クロマチン免疫沈降(Chip)アッセイでその結合を確認した。ラット心筋細胞にフェニレフリン刺激を行い、c-mycで免疫沈降後にPCRを行ったが、結合の確認はできなかった。また、上流のc-myc予測結合部位をdeletionし、ルシフェラーゼアッセイを行った。心筋細胞にvectorをtransfectionさせた後、フェニレフリンまたはAngiotensin II刺激でその発現を観察したが、結合は確認できなかった。
2. ヒト心筋症サンプルを用いたMtus1A蛋白の発現解析 ヒトサンプルを用いて、抗体の条件設定を行った。我々が作成した3種類の交代は、Mtus1の共通配列、Mtus1Aの特異的配列、Mtus1Cの特異的配列を認識するものである。Mtu1の共通配列を認識する抗体では、免疫染色でMtus1の発現を確認することができた。しかし、Mtus1Ａ特異的抗体では染色が弱く、Mtus1C特異的抗体では染色がほとんど見られなかった。また、ウエスタンブロットでも確認したところ、同様の結果であった。我々の作成した抗体はpolyclonalであり、共通部位の抗体でも非特異的なバンドがみられることから、市販のmonoclonal抗体を購入し、追加で検討を行っている。
3. Mtus1遺伝子の変異解析 現在、Mtus1の遺伝子発現解析を行っているが、拡張型心筋症ではMtus1の増加がみられるものや減少しているものが混在しており、発現量と他の臨床指標との相関を調べたが、その関係ははっきりしなかった。現在、肥大型心筋症での発現解析のため、準備中である。遺伝子解析に関しても進めているが、現在のところアミノ酸の変化を伴う変異は見つかっていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1. Mtus1バリアントの発現制御解析 Mtus1の転写因子同定に関しては、c-mycの結合を示すことができなかった。次の候補となる転写因子を確認する予定であり、進捗は概ね順調である。
2. ヒト心筋症サンプルを用いたMtus1A蛋白の発現解析 現在、順調に進んでおり、次年度に達成予定である。
3. Mtus1遺伝子の変異解析 候補となる遺伝子変異は同定できていないが、進捗は順調である。同定できた場合は、機能解析を行っていく。
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| 今後の研究の推進方策 |
Mtus1の転写因子の同定に関しては、in silico解析で次の候補転写因子（CTCF, aMEF-2, FOS/Jun, GATA2）が新たに見つかり、次年度にChipアッセイを行う予定である。また、Mtus1の免疫染色に関しては、monoclonal抗体で特異的な染色が確認できており、基礎心疾患とその発現量の違いに関して次年度検討予定である。遺伝子解析に関しては、最近の報告で、心筋緻密化障害の家系解析から、MTUS1の遺伝子変異が同定され、α tubulinの発現を減少が病態に関与していることが報告された。そのため、他の心筋症も含め解析できるよう計画書を改訂し、次年度も変異遺伝子の同定を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
転写因子や変異遺伝子の同定がまだできていなく、使用金額が少なかった。次年度にin vitro、in vivoを含めた機能解析を行い、使用予定である。次年度、機能解析の際に人件費を支出予定である。コロナウイルスの影響により、学会が中止されたため、旅費の使用ができなかった。次年度は、成果発表、論文投稿の際に支出を検討している。
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