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本年度は、FKBP12と14-3-3β、synaptopodinの詳細な分子間相互作用と、これら3分子の相互作用と細胞内分布へのタクロリムス(Tac)の影響を明らかにする為に、HEK細胞への発現系を用いた免疫沈降(IP)とWestern blot(WB)による解析を行った。まず、FKBP12とsynaptopodinを導入したHEK細胞の内因性14-3-3βをノックダウンする事で、FKBP12とsynaptopodinの相互作用が14-3-3βに非依存的である事を明らかにした。また、HEK細胞への発現系でFKBP12と14-3-3βの相互作用へのsynaptopodinの過剰発現の影響と、synaptopodinと14-3-3βの相互作用へのFKBP12の過剰発現の影響を解析する事で、FKBP12とsynaptopodinが非競合的に14-3-3βと結合する事を明らかにした。更に、FKBP12とsynaptopodinを導入したHEK細胞へのTac添加が、内因性14-3-3βとsynaptopodinのリン酸化状態を変化させる事なく、FKBP12と14-3-3β、synaptopodinの相互作用を増強する事を示した。また、培養ポドサイトに対するTac添加が、FKBP12と14-3-3βを細胞辺縁の分画に移行させ、細胞突起のF-actinのFKBP12発現を増加させる事を示した。
これらの結果から、ポドサイトにおけるFKBP12と14-3-3、synaptopodinの3分子複合体の分子構造を明らかにし、この複合体がアクチン細胞骨格の安定性と細胞突起の維持に機能する事を示した。また、Tacはリン酸化非依存的にFKBP12と14-3-3、synaptopodinの相互作用を増強し、アクチン細胞骨格のFKBP12を保持する事で、ポドサイト傷害を軽減する事を明らかにした。
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