2019 年度実施状況報告書

ラット腎移植拒絶反応モデルにおける血管内皮細胞カベオリン１発現の意義に関する検討

研究課題

研究課題/領域番号	18K16011
研究機関	東京慈恵会医科大学
研究代表者	山本泉東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (60600468)
研究期間 (年度)	2018-04-01 – 2021-03-31
キーワード	ラット腎移植モデル / Caveolin-1
研究実績の概要	【目的】本研究はラット抗体関連型拒絶反応モデル(8週齢のBNラットから8週齢LEWへの移植)を用いて，傍尿細管毛細血管におけるCaveolin-1の発現の意義を解明することを目的としている．【方法及び対象】事前感作モデル(皮膚移植による感作)および無感作モデルにおいて、IHCによる病理組織学的評価を行う．具体的には，皮膚感作モデルの移植後48時間，72時間，96時間後のグラフトと無感作モデルの移植後7日のグラフトをサンプルとして用いる．Caveolin-1に対する抗体はmonclonal抗体（clone: 7C8）を用いた．なお，病態モデル以外にコントロールとして，Native kidney（Donor 0 hour kidney）を使用した．【結果】Native Kidneyを用いて、IHC、ウエスタンブロット(Simple Western TM)およびリアルタイムPCRの条件設定を行った. IHCでは、一次抗体(mouse monoclonal antibody caveolin-1(7C8), sc-535)100倍希釈、二次抗体(Goat anti-Mouse IgG H&L(Alexa Fluor488, ab150113)×200倍希釈にて良好な染色性が得られた。ウエスタンブロットでは、サンプル濃度1.25μg/μLで、Caveolin-1 antibody (R＆D system AF5736×10倍希釈, CST＃3267×50倍希釈)にて、29kDa付近にピークを持つ蛋白発現を確認した。リアルタイムPCRに関しては、TaqMan; probes for rat CAV-1（Assay ID Rn00755834_m1）を使用し、良好な結果が得られた。ラット移植腎モデルの作成を順次施行しているが, ラット腎移植後の生存率にばらつきがあるため,条件を補正中である.
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由 IHC、ウエスタンブロット、リアルタイムPCRそれぞれの条件設定は整ったものの、ラット移植腎モデルの作成に遅延がある。ラット腎移植後の生存率にばらつきがあり、データ解析にまでは至っていない。
今後の研究の推進方策	来年度以降は、ラット抗体関連型拒絶反応モデルの検体を用いて、条件設定を確立したウエスタンブロット、リアルタイムPCRでのデータ解析を実施する。また、Caveolin-1阻害剤(Daizein)を投与した群としなかった群での比較検討も行う予定である。
次年度使用額が生じた理由	免疫染色、ウエスタンブロット、リアルタイムPCRの条件設定に経費が生じた.来年度以降は、ラット抗体関連型拒絶反応モデルの検体を用いて、条件設定を確立したウエスタンブロット、リアルタイムPCRでのデータ解析を実施する.また、Caveolin-1阻害剤(Daizein)を投与した群としなかった群での比較検討も行う予定である.