急性骨髄性白血病におけるDUSP4の役割と治療応用

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K16121
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 安東 恒史 長崎大学, 原爆後障害医療研究所, 助教 (90571357)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: DUSP4 / FLT3-ITD / AML / リン酸化シグナル

研究実績の概要

FLT3-ITD (Fms-like tyrosine kinase 3 with internal tandem duplication) を持つ急性骨髄性白血病 (FLT3-ITD AML)は極めて予後不良な一群である。
FLT3-ITD阻害剤はすでに実臨床で使用されているが、その効果は限定的であり十分とは言えない。そのため、FLT3-ITDに対する直接的な阻害剤に加え、FLT3-ITD signalingの下流やその制御機構を含めターゲットとする新規薬剤の開発を行う必要があると考えた。しかし、FLT3-ITD signalingの下流分子やその機能について様々な報告がなされているが、FLT3-ITDのリン酸化シグナル自体の制御機構を含めた病態解明はほとんどなされていない。申請者はこれまでの研究から、FLT3-ITD AMLにおいてDUSP4(dual specificity phosphatase 4)の発現が増殖維持に必須である可能性を見出した。正常造血においては、FLT3の下流リン酸化シグナルの恒常的活性化は起こっていないが、FLT3-ITD存在下では下流シグナル経路であるERK1/2やSTAT5が恒常的にリン酸化され、この恒常的リン酸化は、DUSP4によって時間的、量的にコントロールされていることを発見した。このことは、DUSP4によるリン酸化のコントロールはFLT3-ITD AML細胞に特異的な増殖・分化の調節機序であり、DUSP4の機能阻害が本疾患の新たな治療コンセプトとなる可能性を示している。
本研究でDUSP4のFLT3-ITD陽性AMLにおける役割を明らかにするとともに、DUSP4阻害剤がFLT3-ITD陽性AMLの治療薬候補となり得るのか検討する。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

FLT3-ITDを含む様々変異を持つＡＭＬ細胞株を含む、白血病細胞株にsh DUSP4をlenti virusを用いて導入し細胞増殖の変化について検討した。FLT3-ITD変異をもつMV4-11細胞はsh DUSP4導入により増殖は抑制されることを示した。さらに、FLT3-ITD変異を持たない細胞株では増殖に影響を与えないことを示した。
一方でsh DUSP4が導入された細胞ではFLT3-ITDの下流に存在するSTAT5,ERK1/2のリン酸化は促進されていた。細胞増殖を促進するSTAT5やERK1/2のリン酸化が促進しているという結果は、DUSP4阻害が細胞増殖を抑制しているという結果と矛盾するものであった。
そこで、さらにリン酸化シグナルの時間的量的変化についてフローサイトメトリーを用いて詳細に検討したところ、本来のリン酸化シグナルはnegative feed backなどの機序で時間的にコントロールされていたが、DUSP4が阻害された細胞ではこの時間的リン酸化調節機序が失われていた。そこで、この適切なリン酸化調整機構が失われることで細胞増殖が抑制されるのではないかと考え、現在RNA-seqなどを用いて細胞増殖抑制を来す詳細な機序について検討を進めている。
また、本来の研究計画では、NHD13マウス にFLT3-ITDを強制発現させることでAMLを発症させるFLT3-ITD AMLモデルマウスを使用することを検討していた。しかし、白血病発症のタイミングとDUSP4を抑制するタイミングを調整する必要があり、このモデルマウスを使用した系は煩雑で安定した結果を得ることが難しいことが明らかになった。現在、白血病細胞株を用いた系に変更して研究を進めている。

今後の研究の推進方策

FLT3-ITD陽性のAMLにおいてDUSP4の抑制が細胞増殖強制を来す機序について明確にするため、Ba/F3,HL-60,KG1aなどの細胞株にFLT3-ITDを導入するまたは、FLT3-IT陽性AML細胞株であるMV4-11を用いた系に変更し準備を進めている。それらの細胞にLenti-virusを用いてshDUSP4を導入し細胞増殖の変化について検討することを行っている。それらの細胞を用いて、RNA-seqを行い細胞増殖抑制効果を来すパスウェイを明らかにしようとしている。
すでにDUSP4阻害剤の開発に関して報告があり（Bull.Korean Chem. Soc.;2014:2655-59 Hwangseo et al）、DUSP4阻害剤の有効性について、FLT3-ITD AML細胞株（MV4-11,Molm13）, FLT3正常細胞株　（HL-60,K562,U937）などを用いて検討する。その結果を踏まえ、正常骨髄CD34陽性細胞やFLT3-ITD AML及び正常FLT3 AML患者検体を用い有効性を検討する。
また、リン酸化シグナルの調整因子としてDUSP familyであるDUSP1，DUSP6などがDUSP4の機能を補完している可能性もあり、shDUSP4でノックダウンした際のDUSP1,DUSP6の発現や同時にノックダウンした場合の効果など詳細に検討する必要があると考える。
FLT3-ITDのみならすRas、bcr-abl、Jak2などその他のリン酸化シグナルが重要な働きを示す血液悪性腫瘍におけるDUSP familyの役割や治療ターゲットとなり得る可能性についても検討する。

研究成果

• [学会発表] FLT3-ITD変異陽性AMLのサイトカインシグナル調整におけるPRMT5の役割 (2019)
  • 著者名/発表者名: 安東恒史,Pierre Harmard, Fan Liu, Na Man, Concepcion Martinez, 宮崎 泰司, Stephen Nimer
  • 学会等名: 第81回日本血液学会学術集会