| 研究課題/領域番号 |
18K16141
|
|---|
| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
|---|
研究代表者 |
長谷川 久紀 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 助教 (00707028)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | ヒトiPS細胞由来筋細胞 / 筋細胞傷害 / 筋細胞-CD8T細胞-マクロファージ混合培養 / 多発性筋炎 |
|---|
| 研究実績の概要 |
多発性筋炎/皮膚筋炎(PM/DM)では、副腎皮質ステロイドやメトトレキサート等による病態に非特異的な治療に対し副作用や治療抵抗性を示す症例も多く、病態に基づいたより安全で効果的な新規治療薬の開発が重要である。我々の研究室では、PMモデルマウスを用いて自己免疫性筋炎の発症には、細胞傷害性CD8T細胞だけでなく、筋局所の自然免疫活性化も必須であることを示しているが、PM/DMでの筋炎発症を誘導する自然免疫活性化機序は明らかではない。また、PM/DM患者の筋病変局所でリンパ球と同程度浸潤を認めるマクロファージ(Mψ)や、筋細胞自体の筋炎の病態への寄与も不明である。そこで本研究では、ヒトiPS細胞(hiPS細胞)由来筋細胞を抗原特異的に傷害するCD8T細胞の系に対しMψを混合培養してin vivoの筋病変での炎症性細胞浸潤の状態をex vivoで再現し、Mψや筋細胞自体がCD8T細胞の筋細胞傷害能に与える影響の検証を通じ、PM/DMの病態解明を目指すこととした。
平成30年度(2018年度)は、京都大学河本先生より頂いたhiPS細胞由来WT-1特異的再生CD8+T細胞(CTL)が、WT-1を提示するHLA-A*24:02陽性抗原提示細胞(LCL)により増殖・活性化することを確認にした。また、過去に我々が樹立したPM患者由来のhiPS細胞のドナーでHLA-A*24:02陽性である1例を同定した。そして、HLA-A*24:02陽性hiPS細胞株に対して筋原生転写因子MyoDを導入したMyoD-hiPS細胞が筋細胞へと分化することを確認したので、今後hiPS細胞由来筋細胞に対するWT-1特異的再生CTLの細胞傷害能を検証していく。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2018年度は、hiPS細胞由来筋細胞に対する抗原特異的なCD8T細胞による細胞傷害系の確立を目指した。PM/DMでは、筋炎の病態に関わり、CD8T細胞を活性化させる特異抗原は同定されていない。そこで我々は、河本らがWT1ペプチド特異的CD8T細胞由来のhiPS細胞から分化させたWT1特異的再生CTLに着目した(Cancer Res 2016;76:6839)。WT1を提示するHLA-A*24:02は日本人の約60%がヘテロで有しているので、樹立済みのPM患者由来のhiPS細胞でHLA-A*24:02陽性例を認めれば、そのhiPS細胞を筋細胞へと分化させ、WT1存在下でWT1特異的再生CTLと共培養することで、筋細胞傷害が誘導可能と考えた。
WT1特異的再生CTLとHLA-A*24:02陽性LCLを河本先生より御供与いただき、我々の施設でも、WT1存在下でLCLによりWT1特異的再生CTLが活性化・増殖する条件を確立した。また、樹立済みのhiPS細胞のドナーであるPM患者2名のHLAハプロタイプを解析し、1名がHLA-A*24:02陽性であることを確認した。そして、HLA-A*24:02陽性のPM患者由来のMyoD-hiPS細胞が筋細胞へと分化することを確認した。
LCLによるCTL活性化後、回収した細胞がほぼCTLとなるよう、LCLの増殖を停止させる前処置が必要だが、実験装置の都合上、その前処置を河本研究室とは異なった方法で行なったため、その条件検討に時間を要した。また、CTLと筋細胞の共培養を様々な条件で行えるよう、hiPS細胞から筋細胞への分化を既存の方法よりスケールダウンする必要があり、小さいウェルで筋細胞へと分化する至適hiPS細胞数の条件検討にも時間を要した。よって、hiPS細胞由来筋細胞に対する抗原特異的CD8T細胞による細胞傷害系の確立には至っていない。
|
| 今後の研究の推進方策 |
2019年度は、HLA-A*24:02陽性のPM患者由来のMyoD-hiPS細胞を筋細胞へと分化させ、WT1特異的再生CTLによる筋細胞傷害が生じるか検証する。hiPS細胞からの筋細胞分化誘導条件下での抗原特異的再生CTLの筋細胞傷害至適条件の検討(Effector細胞/Target細胞比、細胞培養培地組成、細胞傷害評価系の検討など)を行う。また、同一PM患者由来hiPS細胞から各Mψサブセット(M1、M2)への分化も開始する。そして、確立した抗原特異的再生CTLによる筋細胞傷害系において各Mψサブセットをそれぞれ共培養し、筋細胞傷害に与える差異を検証できるよう、条件検討を行う。
2020年度以降は、自然免疫活性化因子として筋細胞由来のDAMPsが筋細胞-CTL- Mψの混合培養系に与える影響を検証する。別に準備したhiPS細胞由来筋細胞を過酸化水素水や低酸素環境下で培養して傷害を与え、筋細胞培養上清や筋細胞溶解液(以後、DAMPs含有液)を回収する。そして、筋細胞-CTL-Mψ混合培養系へのDAMPs含有液の有無による筋細胞傷害への影響や、DAMPs含有液のMψや筋細胞への作用による自然免疫活性化への寄与(Mψ、筋細胞のサイトカイン発現プロファイル解析等)の検証を行う。DAMPs含有液が自然免疫活性化・筋細胞傷害に寄与する場合は、原因DAMPsの同定を進める。
以上、上記計画で得られた結果は、適宜、学会等で発表を行っていく。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
当初は、2018年度中に、hiPS細胞由来筋細胞に対する抗原特異的なCD8T細胞による細胞傷害系の確立までを目指していた。しかし、上述したように、WT1特異的再生CTLを活性化する抗原提示細胞LCLの前処置の条件検討とMyoD-hiPS細胞をスモールスケールで筋細胞へと分化させる条件検討に時間を要し、hiPS細胞由来筋細胞とWT1特異的再生CTLの共培養までは実験を進められなかった。そのため、両細胞群の共培養の際、抗原特異的CTLによる筋細胞傷害の至適条件の検討(Effector細胞/Target細胞比、細胞培養培地組成、細胞傷害評価系の検討)時に、hiPS細胞やCTLの培養培地代、細胞傷害評価系試薬代等への使用を予定していた2018年度の請求助成金の一部が2018年度は未使用となったため、次年度使用額が生じた。
|
