| 研究課題/領域番号 |
18K16165
|
|---|
| 研究機関 | 熊本保健科学大学 |
|---|
研究代表者 |
田邊 香野 熊本保健科学大学, 保健科学部, 講師 (20761282)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | クラススイッチ / IgE / CaMKII / NF-κB / アレルギー |
|---|
| 研究実績の概要 |
本年度は「①マウス月齢におけるNF-κB alternative経路およびCaMKII活性化への有意差の検討」のため、成熟マウス脾臓からのB細胞単離条件、IgEクラススイッチ (IgE CSR) 誘導刺激の濃度および時間を検討し、最も適した条件を決定した。この条件の検討はIgE CSRの指標であるεGLTをリアルタイムPCRにより検出した。またCaMKIIの影響を調べるため、CaMKII阻害剤による処理の濃度および刺激時間を決定した。この条件決定により、細胞数の確保が難しい若年マウス脾臓B細胞による実験をより円滑に行うことが可能となる。
また「②CaMKIIノックダウン細胞株樹立と樹立株を用いたCSRへの影響検討」を行うに当たり、Neon®によるB細胞株への遺伝子導入条件の決定を行った。B細胞株に様々な条件でGFP遺伝子を発現させ、最も効率の良い条件と培養時間を調べた。さらにshCaMKIIプラスミドによるCaMKIIノックダウン (KO) 細胞株作成にあたり、まずsiCaMKIIを用いてCaMKIIの一過性KO条件を検討中である。CaMKII KO細胞株樹立には長期的な樹立時間とKO細胞株を選出する検出方法の確立が重要となる。そこでまずsiCaMKIIを用いて検出方法を確立中である。
さらに「③B細胞株を用いたIgE CSRにおけるCaMKIIターゲット分子の探索」にあたり、ターゲット分子の結合やユビキチン化を調べている中でIgE CSRの制御にこれまで検討していなかったホスファターゼ (PP) の関与を示唆する結果を見出した。CaMKIIはB細胞における機能はほとんど報告されていないが中枢神経系ではよく研究されており、CaMKIIと関連するPPの存在も示されている。これまでPPとIgE CSRについては報告が少なく、新しい分子メカニズム解明の一端になる可能性がある。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
現在複数予定しているいずれの実験計画に着手しており、進行中である。
「① マウス月齢におけるNF-κB alternative経路およびCaMKII活性化への有意差の検討」を遂行するに当たり、基本となる条件決定を概ね完了している。しかし若年マウス脾臓B細胞に対して、成熟マウス脾臓B細胞で決定した本条件が適切であるかどうかは検討課題として残されている。
次に「② CaMKIIノックダウン細胞株樹立と樹立株を用いたCSRへの影響検討」ではsiCaMKIIによるCaMKII KO検出条件を検討中であるがタンパクレベルでのCaMKII変化の検出方法が通常のウエスタンブロット法では困難であった。そのため複数の解決案を検討し着手中である。
また「③ B細胞株を用いたIgE CSRにおけるCaMKIIターゲット分子の探索」ではターゲット分子との結合性は確認しているがリン酸化検出がやや難航している。一方でこれまで検討していなかった新しいホスファターゼの発見は今後新しいシグナル伝達経路を見出す可能性が高く、同時並行にその重要性と関連分子を検討中である。
|
| 今後の研究の推進方策 |
まず「① マウス月齢におけるNF-κB alternative経路およびCaMKII活性化への有意差の検討」において予定通り若年および成熟マウス脾臓からB細胞を単離し、IgE CSRにおけるNF-κB alternative経路活性化の違いをウエスタンブロット (WB) で検出する。またIgE CSRへのCaMKIIによる制御の重要性おマウス月齢による差を用いてリアルタイムPCRを用いて検討する予定である。
次に「② CaMKIIノックダウン細胞株樹立と樹立株を用いたCSRへの影響検討」においてCaMKIIは分子サイズが抗体のH鎖に近く、B細胞株では内在的にH鎖を多く有しており、通常のWBでの検出は難しい状況にある。そのためまずは変性IgGを検出しない2次抗体を用いたWBの実施、およびCaMKIIのmRNA合成量の低下を検出しCaMKIIノックダウン時の検出方法を確立する。確立後はすでに条件が決定しているNeon®を用いた遺伝子導入法を用いて、CaMKIIノックダウン細胞株の樹立および樹立株を用いたIgE CSRにおいてCaMKIIの制御を検討する。
また「③ B細胞株を用いたIgE CSRにおけるCaMKIIターゲット分子の探索」において引き続き、刺激下におけるCaMKIIのターゲット分子の同定を進める。さらにターゲット分子が確定後は詳細なリン酸化部位を決定し、NF-κB alternative経路の制御に重要かどうか検出する。さらに本年度の研究により関与が示唆されたホスファターゼについても阻害剤やsiRNAなどを用いて重要性や関連シグナル経路の同定を実施していく予定である。
|
