| 研究課題/領域番号 |
18K16165
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| 研究機関 | 熊本保健科学大学 |
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研究代表者 |
田邊 香野 熊本保健科学大学, 保健科学部, 講師 (20761282)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | クラススイッチ / IgE / CaMKII / NF-κB / アレルギー |
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| 研究実績の概要 |
本年度はまず「マウス月齢におけるNF-κB alternative経路およびCaMKII活性化への有意差の検討」のために、成熟マウス脾臓からのB細胞を単離後、IgEクラススイッチ (IgE CSR) を誘導する刺激を行った。また刺激時における阻害剤による処理に最適な濃度を決定した。次にDirect CSRとsequence CSRを検出するための条件決定のために取り扱いが簡便なマウスB細胞株 M12を用いて検討した。しかしM12はすでにIgG CSRが完了している細胞株であったためDirect CSRとsequence CSRの見当には適さなかった。そこで現在、IgE CSR誘導刺激に反応性のあるヒトB細胞株 Ramosを用いて、条件の検討が進んでいる。
また「CaMKIIノックダウン細胞株樹立と樹立株を用いたCSRへの影響検討」を行うに当たり、shCaMKIIプラスミドによるCaMKIIノックダウン (KD) 細胞株作成を想定している。現在、shCaMKIIプラスミド作成および最適な配列を検討中である。細胞株内のCaMKIIが十分量KDされたかどうかを検出するためにウエスタンブロッティング法によるCaMKIIの検出の改善、およびCaMKIIのmRNA量を検出する方法を併用中である。
さらに「B細胞株を用いたIgE CSRにおけるCaMKIIターゲット分子の探索」にあたり、前年度で明らかにしたホスファターゼ (PP) の関与に関して、Direct CSRとsequence CSRの解明につながる結果を示唆するデータを一部得ている。これを受けて、CaMKIIターゲット分子と共にPPターゲット分子も現在調査中である。今回認められたPPの関与が考えられるシグナル伝達経路はこれまでに報告はなく新しい分子メカニズム解明の一端になる可能性がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在複数予定しているいずれの実験計画に着手しており、進行中である。
「マウス月齢におけるNF-κB alternative経路およびCaMKII活性化への有意差の検討」ではマウス脾臓からのB細胞を用いた実験条件の検討が進んでおり、細胞株を用いてはいるがDirect CSRとsequence CSRを検出する系が概ね条件が決定しつつある。
次に「CaMKIIノックダウン細胞株樹立と樹立株を用いたCSRへの影響検討」ではshCaMKIIによるCaMKII KDに必要なshCaMKIIプラスミド作成への検討がおよび導入の最適な条件見当が進行している。
また「B細胞株を用いたIgE CSRにおけるCaMKIIターゲット分子の探索」ではCaMKIIとターゲット分子が結合性した際のリン酸化検出と共に前年度に明らかとしたホスファターゼ関与に関してのシグナル伝達経路の一部を見出す結果を得ている。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず「マウス月齢におけるNF-κB alternative経路およびCaMKII活性化への有意差の検討」においてヒトB細胞株を用いたDirect CSRとsequence CSRの検出系の確立を行うとともに若年および成熟マウス脾臓からB細胞を単離し、マウス月齢によるDirect CSRとsequence CSRの差とCaMKIIの関与の関係性を探索する。
次に「CaMKIIノックダウン細胞株樹立と樹立株を用いたCSRへの影響検討」においてshCaMKIIプラスミドの完成に伴い、Neon®を用いた遺伝子導入法を用いて、CaMKII KD細胞株を樹立、並びにCSRへの影響を検討する。
また「B細胞株を用いたIgE CSRにおけるCaMKIIターゲット分子の探索」において引き続き、フォスタグビオチンなどを用いたリン酸化の検出を中心にCaMKIIのターゲット分子の同定を進める。さらに前年度の研究により関与が示唆されたホスファターゼについても阻害剤やsiRNAなどを用いて、引き続きIgE CSRへの関与を調べていく予定である。
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