| 研究課題/領域番号 |
18K16180
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
中村 朋文 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 研究員 (00772526)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | HIV-1 / AAV / SaCas9 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の2018年度研究実施内容は、SaCas9を搭載したcapsid遺伝子改変AAV（rAAV-eSaCas9/HIVsgRNA）とeSaCas9を搭載したGesicle-eSaCas9/HIVsgRNAの新しいデリバリーシステムの作成である。AAVはcapsidの血清型によって細胞・組織指向性が変化するウイルスで、AAV capsid のアミノ酸配列に依存している。特定の標的となる細胞・組織への特異的かつ効率の良い遺伝子改変AAVが作製可能である。2018年度は、HIVの感染細胞として主要なCD4陽性T細胞（MT4細胞）に対して指向性の高い遺伝子改変AAVを作成するために、蛍光を発現する能力を有し、様々なキメラcapsidを有するrAAV-Venusの作成を継続した。293T細胞に血清型の異なる様々なプラスミドpAAV-Venusをco-transfectionすることによってモザイクrAAV-Venusを作製した。作製したAAVを再度MT4細胞に感染させ、Venusの発現輝度の高い細胞のみ分離した。細胞内のキメラcapsidの配列を特定し、再度pAAV-Venusにモザイク配列を挿入することによって、よりMT4細胞に指向性の高いrAAV-Venusを作成した（この方法を複数施行した）。遺伝子改変型エクソソームデリバリーシステムは、市販されているGuide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production Systemを購入し、plasmid内にコードされているSpCas9をeSaCas9に変更することによって作製した。また、特異的HIVsgRNA配列も合わせて導入した。作成したplasmidを293T細胞ににトランスフェクションすることによって、種々の細胞に導入可能なeSaCas9/HIV-sgRNAを含有するGesicleを作成した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2018年度に予定していた種々の遺伝子改変rAAV-eSaCas9/HIVsgRNAの作成に関して、血清型の異なるキメラビリオンを作製するためのモザイクベクターを構築することによってMT4細胞に指向性を特化したrAAV-Venusを作成した。また、エクソソーム様小胞（Gesicle）であるGesicle-eSaCas9/HIVsgRNAの新規のデリバリーシステムをある程度構築できた。今後は、それらのeSaCas9/HIVsgRNAデリバリーシステムがどの程度HIV-1を排除可能であるか、解析・評価することによって最も効率のよいデリバリーシステムを確立することが可能な状態となった。したがって、進捗状況は概ね順調であると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
2018年度に予定していた種々の遺伝子改変rAAV-eSaCas9/HIVsgRNAとGesicle-eSaCas9/HIVsgRNAの新規のデリバリーシステムを作成した。今後は、HIV-1が感染可能な細胞であるMT4細胞と異なるU937細胞やPBMC等に対して、作製したrAAV-eSaCas9/HIVsgRNAとGesicle-eSaCas9/HIVsgRNAがどの程度の特異的な感染効率を有するか、かつHIV-1感染細胞内のHIV-1のプロウイルスゲノムをどの程度排除可能であるか等、システムや感染細胞による違いや治療後細胞のHIV-1遺伝子編集効果やHIV-1複製能の詳細を解析する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
物品費は予定よりも支出が多かったが、旅費及び人件費の支出が予定よりも少なかったので、総じて次年度使用金額が生じてしまった。次年度使用金額は、翌年度分の物品費の購入に充てる予定である。
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