胃マイクロバイオーム解析によるピロリ菌関連疾患の疾病パターンの決定

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K16182
• 研究機関: 大分大学
• 研究代表者: 松本 昂 大分大学, 医学部, 助教 (50609667)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 胃マイクロバイオーム / ヘリコバクター・ピロリ / 16S rRNAメタゲノム解析 / ピロリ菌感染 / 次世代シーケンス

研究実績の概要

ヘリコバクター・ピロリ（ピロリ菌）は、人類の約半数の胃に感染する病原性細菌であり。慢性胃炎をはじめ、胃癌、胃十二指腸潰瘍、胃MALTリンパ腫等の疾患発症に関わることが明らかにされている。しかし、実際は、ピロリ菌感染者の数%しか胃癌を発症せず、また、生涯を通じて殆ど症状が現れない不顕性感染例が存在するなど、これら疾患の発症機序には不明な点が多く残る。一方で、ピロリ菌の発見まで、胃は無菌であると長らく信じられてきたが、ごく最近、胃独自の細菌叢（胃マイクロバイオーム）が存在していることが明らかとなり、その役割に関心が向けられている。そこで、我々は、ある特定の胃常在菌の構成が、ピロリ菌の感染や定着性に影響し、胃癌やその他胃十二指腸疾患の疾病パターンを決定しているという仮説を立て、胃マイクロバイオームの同定を試み、この胃マイクロバイオームとピロリ菌の定着および病原性との関連性という独創的な視点からアプローチから、胃十二指腸疾患の発症機序の解明を目指す。
これまでに、収集保管された胃粘膜上皮生検を用いて16S rRNAメタゲノム解析が実施可能なDNA抽出方法を確立し、次世代シーケンサーMiSeqによる解析を実施し、また、解析パイプラインにて類似する16S rRNA遺伝子配列同士をクラスタリングしたOperational Taxonomic Unit（OTU）を決定し、2次解析を行った。加えて、Rapid urease test、細菌培養、病理評価及び抗ピロリ菌血清抗体値の評価を進め、ピロリ菌感染群と非感染群との胃マイクロバイオームの比較を開始した。また、これらノウハウを活かし、関連する共同研究において細菌叢解析の遂行に貢献した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

H30年度研究計画では、上部消化管内視鏡検査により収集・保管された胃上皮生検を用いて、次世代シーケンサーIllumina社MiSeqによる胃マイクロバイオーム解析を実施し、胃における細菌叢を決定することを目標としていた。Rapid urease test（CLO test）、細菌培養、病理評価（HE染色及び免疫組織化学）及び抗ピロリ菌血清抗体値を指標とし、ピロリ菌感染の有無を評価し、4つのテストが全て陰性であった患者をピロリ菌陰性、一方、全て陽性であった患者をピロリ菌陽性患者として群分けした。現在までに、タイ、ブータン、カンボジア、バングラデシュ、ミャンマー、ネパール及びベトナムから収集された379検体（ピロリ菌陽性176検体、ピロリ菌陰性203検体）からDNA抽出を実施し、既存の341F及び805Rプライマー配列にIllumina indexを付加し、16S rRNA遺伝子V3-4領域をPCRにて増幅した。その結果、320検体（84.4%）から増幅産物が確認された。その後、これら増幅産物を精製し、Index PCRを実施後、MiSeqにてPaired-endシーケンス（V3試薬-600cycles）を実施した。
特に、胃における細菌数は、腸内と比べ非常に少なくないことが予想されたが、DNA濃縮及びProtinaseK等の溶解処理を行うことで、一定の結果が得られており、胃マイクロバイオーム解析に必要な細菌DNA抽出方法を確立することができた。現在までに、これら検体のうち192検体がMiSeqによるシーケンス解析が完了しており（96検体×2ラン）、当初の計画していたH30年度研究計画を遂行できた。さらに、先行して実施していた、モンゴルにおける胃癌患者の胃マイクロバイオーム解析についての研究成果をまとめ、2019年にCancers誌にて報告した。

今後の研究の推進方策

現在までに、アジア各国から収集・保管された患者胃粘膜上皮細胞からDNA抽出を行い、このうち192検体について次世代シーケンサーMiSeqによって16s RNAメタゲノム解析を完了した。しかし、迅速安価なDNA抽出法が応用可能であったこと、当初の予定を上回る検体数が本研究に使用可能であったことをうけて、より多くの検体を用いた解析が可能でると考える。そこで、今後の研究方針として、既に上記方法でDNA抽出を終えている検体について、随時DNAライブラリ調整およびMiSeqによるシーケンス解析を進める。これにより、疾患の人種間による差異についての検討及び、国際共同研究の枠組み拡大等が見込まれ、よりダイバーシティーに富む研究成果が期待できる。加えて、H31年度以降は、これら検体について、シドニー分類を用いた胃粘膜上皮細胞の病理学検査を進め、慢性胃炎および潰瘍等のスコアを評価する。
興味深いことに、我々の予備的な胃マイクロバイオーム解析では、これら臨床検査にてピロリ感染陰性であった症例にもピロリ菌由来遺伝子が検出されており、胃内には、これまで顕在化していなかったごく少数のピロリ菌が常在している可能性も示唆された。今後は、ピロリ菌の菌数と胃マイクロバイオームの構成変化に着目し関連性を検討する。さらに、現在、CLC Genomics workbench (GUI)を用いて16S rRNAメタゲノム解析を実施しているが、世界的標準であるQiime (Linux)を用いたデータ解析も進め、これに伴う解析環境の構築に取り組みたい。

次年度使用額が生じた理由

平成30年度7月に行った、胃粘膜上皮生検からのDNA抽出方法に関する予備試験の結果、当初の予想に反し、Proteinase Kを用いた処理により細胞溶解が完了でき、その他のプロテアーゼを用いた溶解方法と比較しても大きな差異が認められなかったことから、多検体の解析を目標とする本研究の目的に沿って、より簡便で安価なDNA抽出方法を選定するに至った。このため、当初予定していたよりも多くの検体を予算内で処理できる可能性が生じ、平成31年度以降にこれら検体に関するDNAライブラリ調整およびMiSeqによるシーケンス解析の為の予算を確保しておく必要があったため、DNA抽出が完了する次年度以降に予算を繰り越すこととした。

研究成果

• [国際共同研究] JDWNRH(ブータン)
  • 国名: ブータン
  • 外国機関名: JDWNRH
• [国際共同研究] Dhaka Medical College and Hospital/BIRDEM(バングラデシュ)
  • 国名: バングラデシュ
  • 外国機関名: Dhaka Medical College and Hospital/BIRDEM
• [国際共同研究] Yangon General Hospital/Mandalay General Hospital/Thingangyun Sanpya General Hospital(ミャンマー)
  • 国名: ミャンマー
  • 外国機関名: Yangon General Hospital/Mandalay General Hospital/Thingangyun Sanpya General Hospital
• [国際共同研究] Thammasat University/Rajavithi Hospital/Bangkok Medical Center(タイ)
  • 国名: タイ
  • 外国機関名: Thammasat University/Rajavithi Hospital/Bangkok Medical Center
• [国際共同研究] Cho Ray Hospital Ho Chi Minh/Daklak Hospital/Lao Cai Hospital(ベトナム)
  • 国名: ベトナム
  • 外国機関名: Cho Ray Hospital Ho Chi Minh/Daklak Hospital/Lao Cai Hospital
  • 他の機関数: 2
• [国際共同研究]
  • 他の国数: 3
• [雑誌論文] Dysbiosis of the Gut Microbiota on the Inflammatory Background due to Lack of Suppressor of Cytokine Signalling-1 in Mice. (2019)
  • 著者名/発表者名: Gendo Y, Matsumoto T, Kamiyama N, Saechue B, Fukuda C, Dewayani A, Hidano S, Noguchi K, Sonoda A, Ozaki T, Sachi N, Hirose H, Ozaka S, Eshita Y, Mizukami K, Okimoto T, Kodama M, Yoshimatsu T, Nishida H, Daa T, Yamaoka Y, Murakami Km, Kobayashi T.
  • 雑誌名: Inflammatory Intestinal Diseases. 巻: 3 ページ: 145-154
  • DOI: 10.1159/000495462.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Techniques in 16S Metagenomics and Stomach Microbiome. (2019)
  • 著者名/発表者名: Takashi Matsumoto
  • 学会等名: At Universiti Malaysia Sabah (Malaysia) as Guest Speaker
• [学会発表] ヘリコバクター・ピロリ感染による胃細菌叢の変化 (2018)
  • 著者名/発表者名: 松本昂、山岡吉生
  • 学会等名: 第71回日本細菌学会九州支部総会・第55 回日本ウイルス学会九州支部総会
  • 国際学会
• [学会発表] 胃マイクロバイームに関する検討 (2018)
  • 著者名/発表者名: 山岡吉生、松本昂
  • 学会等名: 第50回九州微生物研究会総会
  • 国際学会
• [学会発表] Microbiome in the stomach and Helicobacter pylori infection in Asian population. (2018)
  • 著者名/発表者名: Takashi Matsumoto
  • 学会等名: Seminar on the Formation of gastrointestinal infectious disease center mainly focused on Helicobacter pylori infection in African countries. (JSPS Core-to-Core program) at KEMRI, Kenya.
• [学会発表] Microbiome in the stomach and Helicobacter pylori infection in Asian population. (2018)
  • 著者名/発表者名: Takashi Matsumoto
  • 学会等名: Seminar on the Formation of gastrointestinal infectious disease center mainly focused on Helicobacter pylori infection in African countries. (JSPS Core-to-Core program) at Aga Khan University, Kenya.
• [図書] Microbiota: Current Research and Emerging Trends (2019)
  • 著者名/発表者名: Takashi Matsumoto and Yoshio Yamaoka
  • 総ページ数: 126
  • 出版者: Caister Academic Press
  • ISBN: 978-1-910190-94-4
• [備考] 大分大学医学部環境・予防医学講座
  • URL: http://www.med.oita-u.ac.jp/phealth2/http://www.med.oita-u.ac.jp/phealth2/