| 研究課題/領域番号 |
18K16250
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
荒 桃子 北海道大学, 大学病院, 医員 (30741219)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 肝芽腫 / シスプラチン耐性 / DNAメチル化 / 遺伝子発現変動 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、肝芽腫におけるシスプラチン（CDDP）耐性に関与するエピゲノム異常、遺伝子発現異常を解析し、分子マーカーの確立、耐性の解除・新たな治療ターゲットを模索することである。
肝芽腫患者より抽出したDNAサンプルにバイサルファイト処理を施し、ビーズアレイを用いて網羅的メチル化解析を行う。さらに肝芽腫細胞株を用いてCDDP耐性株を作成し、非耐性株と比較した遺伝子発現の変化を解析する。細胞株はHepG2、HuH6を用い、両細胞株でRNAによる発現アレイを施行し、双方で共通して発現変動している遺伝子を、CDDP耐性候補遺伝子として抽出する。さらに、研究を進めていくうちに、CDDP暴露後に遺伝子発現プロファイルが大きく変動していることもわかったため、定常状態での遺伝子発現プロファイルの比較に加え、CDDP暴露後の各細胞株よりRNAを抽出して発現アレイを施行し、発現プロファイルを比較する。これらのアレイデータを解析し、CDDP耐性に関与する遺伝子をより信頼性高く抽出する。また、臨床検体のビーズアレイによるメチル化データと掛け合わせて、エピゲノムにより制御されるバイオマーカー遺伝子を選出する。バイオマーカー候補遺伝子に対し、バイサルファイトパイロシークエンシング法を用いて、他の臨床検体でメチル化率を測定・解析を行い、予後予測や再発・治療抵抗性予測のバイオマーカーとして確立する。
また、がん細胞株で候補遺伝子の遺伝子操作を行い、各細胞機能やCDDP耐性への関与を明らかにする。候補遺伝子の中で、EMTを介した転移能獲得に寄与する可能性のある遺伝子は、遺伝子操作を行った細胞株を作成したのち、CTC free肝転移モデルを作成し、その影響をin vivoで証明する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
DNAメチル化解析はほぼ完了している。HepG2を用いて、耐性株（CR）と非耐性株（WT）の発現アレイ解析を行った。その結果より、定常状態にHepG2CRで上昇している遺伝子は7358遺伝子であり、低下している遺伝子は9740遺伝子であった。さらに、CDDP24時間暴露後の発現アレイ解析を行い、CDDP負荷後にHepG2CRで発現上昇していたのは7625遺伝子、発現低下していたのは8129遺伝子であった。これらに共通していたもの、すなわちCDDP暴露後しばらくして定常状態となった際に上昇または低下しており、かつCDDP暴露後も高値または低値を維持（WTを下回らない/上回らない）している遺伝子はそれぞれ6107遺伝子、3216遺伝子であった。これは、化学療法施行後に手術により切除された患者の臨床サンプルと類似した状況となっており、メチル化アレイの結果との掛け合わせで、より精度高く候補遺伝子の抽出ができると考えられた。現段階ではメチル化ビーズアレイの結果と発現アレイの結果より、高メチル化が低発現に関与していると考えられる5遺伝子、低メチル化が高発現に関与していると考えられる4遺伝子を同定した。
HuH6を用いたアレイ解析は以前に施行していたが、用いたチップがプローブ数の少ないものであったため、HepG2の解析で施行したものと同じチップを用いたアレイ解析を再試行することとし、現在進行中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
HuH6のアレイ解析を進め、CDDP耐性と強い関連が予想される候補遺伝子を抽出する。これらのアレイデータを用いて、エピジェネティックな発現制御が疑われる遺伝子、CDDP負荷時に生存のために発現変動しうる遺伝子など、様々な状況でのCDDP耐性のキーとなる遺伝子、pathwayの解析を行う。
抽出された候補遺伝子に対し、臨床検体のDNAサンプルを用いてバイサルファイトパイロシークエンスを行い、予後や再発、CDDP耐性など臨床学的所見との相関などを解析する。また、抽出された候補遺伝子の遺伝子操作株を作成し、細胞機能の変化（CDDP耐性能、排出能、浸潤能、接着能、EMT関連遺伝子の発現変化など）をそれぞれのアッセイで評価し、候補遺伝子のCDDP耐性獲得に際する機能を評価する。
CDDP耐性候補遺伝子の遺伝子操作を行った細胞株を作成し、in vitroで耐性能の変化を確認したのち、ヌードマウスを用いた動物評価モデルを確立し、in vivoで評価する。ヌードマウスに遺伝子操作を施した肝芽腫細胞株を注入し肝癌モデルを作成し、CDDP耐性能の評価を行い、耐性遺伝子として確立する。
CDDP耐性候補遺伝子のうち、EMTへの関連が示唆される遺伝子に関し、遺伝子操作株を作成し、ヌードマウスによる肝腫瘍モデルを作成する。肝腫瘍生着ののち、肝臓を摘出、washoutすることで血管内のCTC除去でき、純粋な腫瘍肝を移植し転移能の正確な評価を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
マイクロアレイ解析の検体数が、当初予定していた数より少なく済んだため、次年度使用額が生じた。これらは、臨床検体のバイサルファイトパイロシークエンスやメチル化ビーズアレイなど、他の解析に使用する予定である。
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