| 研究課題/領域番号 |
18K16255
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
渡邉 健司 山口大学, 大学研究推進機構, 助教 (50711264)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | SIN3A / 乳がん |
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| 研究実績の概要 |
ERα 陽性乳がんの治療の一つとして内分泌療法が行われるが、多くの場合耐性が認められる。耐性を打破するためには、恒常的な ERα 高発現を抑制する効果的な治療法の開発が必要である。一方、乳がんはゲノム異常の蓄積が病態に関与する。申請者らは、ERα 発現を増加させる遺伝子変異の同定を試みた。申請者らは、ERα 発現を増加させる遺伝子変異を同定するため、これまでにERα 高発現群、低発現乳がん患者組織のゲノムDNAについて、次世代シークエンサーを用いた全エクソーム解析を行った。検出した変異遺伝子の内、ERα の上流に位置し、ERα の発現を抑制する機能が報告されていた Switch-Independent 3 Transcription Regulator Family Member A (SIN3A) の変異に着目し、ERα 発現に対する機能を検討した結果、(i) 変異体は ERα の発現を上昇させるLoss-of-function 変異であること、(ii) 変異体は、乳がん細胞株の増殖を促進することを見出すことができた (Watanabe et al., Sci. Rep., 2018) 。現在、SIN3A変異体の機能をさらに詳細に検討するために、Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery (GONAD)法を用いてSIN3A変異体を乳腺特異的に発現するノックインマウスの作成を試みている。この方法は、これまで熟練の技術が必要であった採卵、核酸の顕微注入、移植操作をなくすことで、小規模研究室でも遺伝子改変マウスを作製することを可能にする画期的な手法である。この方法を用いてSIN3A 変異体ノックインマウスを作成し、機能を詳細に検討していく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究では、SIN3A変異乳がんの分子機構を解明し、治療標的を同定するために、以下の３点について明らかにすることを考えた。①Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery (GONAD)法により、乳腺特異的変異SIN3A発現マウスを作成する。②作成したマウスまたは、SIN3A 変異導入ヒト乳がん細胞株を用いてSIN3A機能低下乳がんにおける標的遺伝子の同定を行う。③作成したマウスにおいて腫瘍の発生を確認できた場合、同定した標的分子に対する治療薬の効果を検討する。上記の内容を実行するために、以下の方法を計画していた。 1年目は、CRISPR/Cas9システムおよびGONAD法による乳腺特異的SIN3A変異体発現マウスの取得として、①-1 CRISPR/Cas9発現プラスミドの作製・活性評価、①-2 GONAD法による受精卵への遺伝子導入を予定していたが、GONAD法により作成するSIN3A変異体導入マウスの前提となるSIN3A変異体の乳がんにおけるERalpha 発現を上昇させる機能の証明に時間がかかったため、少し遅れており、ノックイン用ベクターを調製中である。しかしながら、①-2 に関しては、研究協力者により、GONAD法を用いたノックアウトマウスの作成が概ねうまくいくことを確認している。
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| 今後の研究の推進方策 |
申請者らは、ERα 発現を増加させる遺伝子変異を同定するため、これまでにERα 高発現群、低発現乳がん患者組織のゲノムDNAについて、次世代シークエンサーを用いた全エクソーム解析を行った結果、ERalpha 発現を上昇させる遺伝子変異SIN3Aを同定することができた(Watanabe et al., Sci. Rep. 2018)。今後は、ノックインマウス作成のため作成しているベクターを完成させ、研究協力者の協力を得てSIN3A変異体ノックインマウスを作成していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
昨年度には、SIN3A 変異体ノックインマウスが完成予定で会ったが、まだ完成しておらず、引き続きノックインマウス作成のための検討を行う必要がある。SIN3A 変異体ノックインマウスを作成するため、以下のように予算の使用を予定している。CRISPER/CAS9発現プラスミドの準備費用として、20 万円を想定している。ノックインベクターのサブクローニング費用として5 万円を想定している。 エレクトロポレーション用試薬の購入費として、40 万円を想定している。培地等の細胞培養用試薬として10万円を想定している。ノックイン細胞の細胞増殖機能確認のためのxCELLigence 用試薬 xCELLigence のランニング費用 (E-プレート)として、10 万円を想定している。ICRマウス、Cre-Tg マウスの購入・維持費として10万円を想定している。細胞の培養に必要な血清、培地やディッシュ、プレート等に年間5万円を見込んでいる。成果について日本分子生物学会、日本生化学会で発表するために、旅費として10万円を想定している。
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