| 研究課題/領域番号 |
18K16282
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
大野 慎一郎 長崎大学, 病院(医学系), 助教 (90567174)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 膵島移植 / 膵島細胞シート / CRISPER/CAS9 / MHC class1 抑制 / 免疫寛容 |
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| 研究実績の概要 |
研究代表者は間葉系細胞をシート化し膵島と培養、膵島細胞シートを皮下へ移植し膵島単独移植時より機能維持、生着することを報告している。本研究ではCRISPR/Cas9システムによりMHC class Iを構成する分子であるβ2ミクログロブリン遺伝子を欠失するように膵島細胞に対して遺伝子編集を行い、MHC class Iの発現を抑制し宿主のT細胞から認識出来なくし拒絶反応を軽減することを目的としている。腫瘍免疫を利用した癌治療において同手法でT細胞への遺伝子導入、MHC class Iの発現抑制およびin vitroでのアロ反応抑制を確認しているが、非血液系細胞では実験手法が確立出来ていない。まずは肝癌細胞株HepG2を用いて実験系の確立を行った。HepG2を培養しレンチウイルスベクターを用いて遺伝子導入を行いFACSでMHC class Iの表出を確認、25-29％の細胞で陰性化を認めた。更に純粋なMHC class I陰性分画を得る目的で磁気ビーズ分離法を行い、MHC class I陰性の細胞を96%の純度で得られた。以上より、非血液系細胞でも遺伝子導入によるMHC class Iの抑制および高純度のMHC class I抑制細胞の細胞を分離出来た。
次にヒト膵島細胞を輸入、状態が良好な膵島を顕微鏡下に採取、トリプシン処理にて単細胞化後、HepG2に行った同様の方法で遺伝子導入を試みた。FACSで遺伝子導入前後のMHC class Iの発現割合の変化を確認しようとしたが、MHC class I陰性分画が多く、明確な変化を認めなかった。外分泌腺及び死細胞の混入が原因と考えられたため、β細胞のみを分離。MHC class Iを測定するとやはり発現率が10%に満たないという結果であった。MHC class Iを発現しているβ細胞に導入するも、導入効率が悪く発現抑制を確認できなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
アルバータ大学からヒト膵島細胞を輸入、状態が良好な膵島を顕微鏡下に採取、トリプシン処理にて単細胞化後、HepG2に行った同様の方法で遺伝子導入を試みた。FACSで遺伝子導入前後でMHC class Iの発現割合の変化を確認しようとしたが、MHC class I陰性分画が多く、明確な変化を認めなかった。外分泌腺及び死細胞の混入が多いことが原因と考えられたため、β細胞を分離しMHC class１の発現を確認。しかしながらclass１発現頻度は低く、また細胞のviabilityが悪いのかウイルスベクター法での導入効率悪く、MHC class１の発現抑制を確認できなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後はiPS細胞由来のβ細胞株を用い、同様の実験を行い、最終的には遺伝子導入細胞をビーズ分離法にてセレクションを行い、99%とより高純度のMHC抑制細胞を作製。このMHC抑制細胞をターゲットとしアロ細胞と共培養を行い、混合リンパ球試験を行い、アロ細胞の活性化の低下を確認することで、MHC発現抑制細胞は抗原性が低下することを証明する予定である。
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