緑膿菌感染症の自然免疫における抗体価の経時的解析と最適な獲得免疫の判定基準の検討

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K16521
• 研究機関: 京都府立医科大学
• 研究代表者: 木下 真央 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20816384)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 抗体価推移 / V抗原 / Ⅲ型分泌毒素

研究実績の概要

多剤耐性緑膿菌（MDRP）といった薬剤耐性グラム陰性桿菌による医療関連感染症が広がり、抗生剤に頼らない治療が社会的に求められている。我々はこれまでに、緑膿菌感染症に対する抗体療法・ワクチン療法について取り組んできた。研究成果より臨床で唯一使用することのできる免疫グロブリン製剤の受動免疫効果や経鼻ワクチンによる能動免疫療法の抗緑膿菌作用を見出した。本研究では、これらの成果をふまえて、緑膿菌に感染した時の生体の防御免疫機構について着目し、自然免疫における抗緑膿菌抗体価の経時的解析を行い、抗体価や生存に影響を与える因子を検討する。さらに多剤耐性緑膿菌株や免疫抑制状態の動物モデルを用いて獲得免疫のメカニズムの解明にむけた基礎研究を行ない、今後の臨床応用へと発展させたい。
令和2年までに①遺伝子組み換え緑膿菌V抗原タンパクの作成②緑膿菌性肺炎モデルによるPcrV抗体価の経時的解析を進めた。その結果、新たに緑膿菌性肺炎モデルにおいてPcrVとExoUに対する血清中のIgG・IgAは8週間を通じて抗体価の上昇は認めなかったが、緑膿菌投与群においてPcrVとExoUに対する血清中のIgMは4週まで上昇し、5週後から低下することが明らかとなった。緑膿菌感染症は初回感染におけるPcrV・ExoUに対する血清IgMの反応は認めたが、獲得免疫に必要な血清IgGの上昇を認めなかった。今後は自然免疫における抗緑膿菌抗体価の経時的解析が呼吸器感染病態のメカニズムの解明につながり、さらには新規治療戦略になる可能性について究明したい。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

①遺伝子組み換え緑膿菌V抗原タンパクの作成②緑膿菌性肺炎モデルによるPcrV抗体価の経時的解析に加えて③緑膿菌性肺炎モデルの生存率・体温変化・肺浮腫の程度・気管支肺胞洗浄中の抗体価の解析に関するプロジェクトが概ね順調に進展している。

今後の研究の推進方策

今後は緑膿菌性肺炎モデルの生存率・体温変化・肺浮腫の程度・気管支肺胞洗浄中の抗体価の解析に加えて緑膿菌に感染した時の生体の防御免疫機構についてさらに抗緑膿菌抗体価（OprF, EndotoxinA, mTox）の経時的解析も行う予定である。また免疫ブロット法による抗体価に関連する新たな抗原の探索として亜致死量の緑膿菌感染で生存したマウスで生存したマウスから採血した血液と緑膿菌表面抗原を用いて免疫ブロットを行う。緑膿菌PA103株・多剤耐性緑膿菌株をTSB培地を用いて培養する。その後遠心し、沈殿物をsucrose含有バッファーによって溶解する。再度遠心し、上清を破棄したのち、ペレットをsucrose非含有バッファーにより溶解し、遠心後上清を回収する。表面抗原の抽出液をSDS-PAGEに注入する。その後ゲルを取り出しメンブレンに転写する。次に一次抗体として生存したマウスの血液を、二次抗体(Anti-Mouse IgG-Peroxidase antibody produced in rabbit)の反応後、最後にDAB(3,3’-diaminobenzidine)で発色し反応を確認する。
これら2つの過程を通して獲得免疫のメカニズムの解明と緑膿菌感染症に対する新規ワクチン抗原の発見のため基礎研究を継続し、今後の臨床応用へと発展させたい。

次年度使用額が生じた理由

概ね順調に進んでおり、抗体価推移・動物実験がが順調に進んだために、当該年度の予算より少ない経費で実施可能であった。来年度以後に経費を振り分け、新たな知見を深めたい。また新たな抗原タンパクの作成や実験器具を購入するため上記費用が発生している。

研究成果

• [雑誌論文] Epidemiological survey of serum titers from adults against various Gram-negative bacterial V-antigens (2020)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita Mao、Shimizu Masaru、Akiyama Koichi、Kato Hideya、Moriyama Kiyoshi、Sawa Teiji
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 15 ページ: e0220924
  • DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220924
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Molecular epidemiology of clinically high‐risk Pseudomonas aeruginosa strains: Practical overview (2020)
  • 著者名/発表者名: Sawa Teiji、Momiyama Kyoko、Mihara Toshihito、Kainuma Atsushi、Kinoshita Mao、Moriyama Kiyoshi
  • 雑誌名: Microbiology and Immunology 巻: - ページ: -
  • DOI: https://doi.org/10.1111/1348-0421.12776
  • 査読あり
• [雑誌論文] Secondary in-hospital epidemiological investigation after an outbreak of Pseudomonas aeruginosa ST357. (2020)
  • 著者名/発表者名: Mihara T, Kimura T, Momiyama K, Kainuma A, Akiyama K, Ohara J, Inoue K, Kinoshita M, Shimizu M, Moriyama K, Fujita N, Sawa T.
  • 雑誌名: J Infect Chemother. 巻: 26 ページ: 257-265
  • DOI: https://doi.org/10.1016/j.jiac.2019.09.014.
• [雑誌論文] Immunoglobulin for Treating Bacterial Infections: One More Mechanism of Action (2019)
  • 著者名/発表者名: Sawa、Kinoshita、Inoue、Ohara、Moriyama
  • 雑誌名: Antibodies 巻: 8 ページ: 52～52
  • DOI: https://doi.org/10.3390/antib8040052
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Reduction of the rocuronium-induced withdrawal reflex by MR13A10A, a generic rocuronium with a novel solution: A randomized, controlled study (2019)
  • 著者名/発表者名: Shimizu Masaru、Amaya Fumimasa、Kinoshita Mao、Yamasaki Masaki、Yokota Isao、Sawa Teiji
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 14 ページ: e0223947
  • DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0223947
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 下咽頭腫瘍の急速な進行により全身麻酔導入後に挿管困難・換気困難(CVCI)となった症例 (2019)
  • 著者名/発表者名: 梅田 洋平, 清水 優, 木下 真央, 佐和 貞治
  • 学会等名: 日本臨床麻酔学会第39回大会
• [学会発表] 先天性フィブリノゲン分子異常症を有する患者の整形外科手術の周術期管理の1症例 (2019)
  • 著者名/発表者名: 坂本 翔太郎, 清水 優, 木下 真央, 石丸 俊貴, 笹川 奈央, 東 彩華, 佐和 貞治
  • 学会等名: 日本臨床麻酔学会第39回大会
• [学会発表] スガマデクス-ロクロニウム複合体によるアナフィラキシーと診断した患者の周術期管理について (2019)
  • 著者名/発表者名: 笹川 奈央, 清水 優, 石丸 俊貴, 坂本 翔太郎, 木下 真央, 佐和 貞治
  • 学会等名: 日本臨床麻酔学会第39回大会
• [学会発表] 褐色細胞腫摘出術をProAQT/PulsioFlexを用いて麻酔管理した1症例 (2019)
  • 著者名/発表者名: 石丸 俊貴, 木下 真央, 坂本 翔太郎, 笹川 奈央, 清水 優, 佐和 貞治
  • 学会等名: 日本臨床麻酔学会第39回大会
• [学会発表] 線維形成によって過小評価され治療時期に難渋した心室中隔欠損の一例 (2019)
  • 著者名/発表者名: 串本 洸輔, 小原 潤也, 藤田 太輔, 木下 真央, 清水 優, 佐和 貞治, 溝部 俊樹
  • 学会等名: 日本心臓血管麻酔学会第24回学術大会
• [学会発表] カテーテル室における心房細動のカテーテルアブレーションに対する全身麻酔の当院での取り組み (2019)
  • 著者名/発表者名: 加藤 秀哉, 竹田 智浩, 清水 優, 木下 真央, 甲斐沼 篤, 米 温子, 中野 由衣子, 山羽 悠生子, 鬼頭 秀樹
  • 学会等名: 日本心臓血管麻酔学会第24回学術大会
• [学会発表] 経カテーテル大動脈弁留置術(TAVI)における1年死亡に影響する因子の検討 単施設後方的観察研究 (2019)
  • 著者名/発表者名: 清水 優, 木下 真央, 小原 潤也, 三原 聡仁, 井上 敬太, 橋本 悟, 佐和 貞治, 溝部 俊樹
  • 学会等名: 日本心臓血管麻酔学会第24回学術大会
• [学会発表] 慢性大動脈弁逆流症における左室エナジーロスは患者の自覚症状を反映する (2019)
  • 著者名/発表者名: 甲斐沼 篤, 秋山 浩一, 内藤 慶史, 小原 潤也, 清水 優, 木下 真央, 加藤 秀哉, 溝部 俊樹, 佐和 貞治
  • 学会等名: 日本心臓血管麻酔学会第24回学術大会
• [学会発表] ARDSにおける予後および患者背景因子の検討 単施設後方的観察研究 (2019)
  • 著者名/発表者名: 清水 優, 木下 真央, 三原 聡仁, 橋本 悟, 佐和 貞治
  • 学会等名: 第46回日本集中治療医学会学術集会
• [学会発表] Becker型筋ジストロフィー小児患者の右室二腔症患者に対し、完全静脈麻酔を施行した一例 (2019)
  • 著者名/発表者名: 湯浅 健人, 清水 優, 山下 理比路, 井上 敬太, 木下 真央, 佐和 貞治
  • 学会等名: 第46回日本集中治療医学会学術集会
• [図書] 経食道心エコーハンドブック-2D TEE-（改訂第2版） (2019)
  • 著者名/発表者名: Annette Vegas
  • 総ページ数: 63～83
  • 出版者: 克誠堂出版
  • ISBN: 978-4-7719-0525-2 C3047